肉毒毒素重組基因工程疫苗研究.pdf

1、肉毒毒素又被稱為肉毒神經(jīng)毒素，是由厭氧的革蘭氏陽性菌肉毒梭菌產(chǎn)生的外毒素，是已知毒性最強的蛋白，根據(jù)其抗原性不同可以分為7種類型（BoNT/A-BoNT/G），A、B、E和F型可以導致人類中毒，其中A型肉毒毒素中毒致死率最高。各型肉毒毒素分子結(jié)構(gòu)比較相似，分子量大小約150 kDa，由二硫鍵連接一個100 kDa的重鏈（HC）和一個50 kDa的輕鏈（LC）組成。肉毒毒素重鏈羧基端（HC）負責與細胞受體的結(jié)合，重鏈氨基端（HN）介導L鏈

2、的跨膜轉(zhuǎn)運；輕鏈具有鋅離子內(nèi)肽酶活性，能夠?qū)⒖扇苄訬-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）切割而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，最終會導致骨骼肌麻痹，呼吸衰竭而死亡。
　　肉毒毒素生產(chǎn)工藝簡單，穩(wěn)定性良好，具有極強的致死性，是一種潛在的生物武器，極容易被制備成生物戰(zhàn)劑應(yīng)用。此外，近些年來由于肉毒毒素導致的中毒事件也時有發(fā)生，因此，對于預(yù)防和治療肉毒毒素中毒的研究具有十分重要的意義。接種疫苗是一種有效預(yù)防肉毒毒素中毒的策略。鑒于早期

3、研制的類毒素疫苗存在較多的缺陷，所以一直未能得到十分廣泛的應(yīng)用，因此研究新型肉毒毒素疫苗成為一種迫切的需要。破傷風毒素（TeNT）和肉毒毒素在結(jié)構(gòu)上有較多的相似之處，所以借助于破傷風毒素 Hc片段亞單位疫苗研究成功的策略來研制肉毒毒素亞單位疫苗。肉毒毒素受體結(jié)合區(qū) Hc能介導毒素特異性結(jié)合到神經(jīng)肌肉接點處的神經(jīng)末梢，此外，Hc片段不存在鋅肽鏈內(nèi)切酶活性，沒有毒性，免疫動物后能刺激產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)?；谶@一重要發(fā)現(xiàn)，研究人員開始以肉毒毒

4、素受體結(jié)合區(qū) Hc為靶標，開展新型肉毒毒素重組亞單位疫苗和核酸疫苗的研究。
　　DNA疫苗是將編碼抗原的基因克隆到真核表達載體中作為疫苗，免疫動物后該載體會在體內(nèi)表達抗原，繼而刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和保護作用。DNA疫苗具有很多優(yōu)點：生產(chǎn)工藝簡單、產(chǎn)品易純化、便于儲存，在接種者體內(nèi)表達抗原，并且能夠產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，然而，DNA免疫原性較低，不足以提供足夠的保護作用，距離真正的人類臨床應(yīng)用還有一定的差距，需要進一步提高與放

5、大祼DNA的免疫效果。樹突狀細胞（DCs）是體內(nèi)已知最強的專職抗原遞呈細胞，在抗原遞呈和啟動機體免疫應(yīng)答中具有十分重要的作用。DEC205是表達于樹突狀細胞表面的內(nèi)吞性受體，能夠高效地介導抗原的攝取、加工處理以及遞呈。為了增強肉毒毒素 DNA疫苗的免疫原性，本研究開展了A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc抗原靶向DCs的DNA疫苗研究工作。將編碼抗DEC205的抗體基因（scDEC）和編碼 A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)基因（AHc）融合，并克隆到真核表

6、達載體pVAX1中，構(gòu)建了一個DCs靶向的DNA疫苗（pVAX1-scDEC-AHc）,同時還設(shè)置了非靶向的疫苗載體（pVAX1-SAHc）和陰性對照（pVAX1）。免疫小鼠后證明該DCs靶向的DNA疫苗確實能夠增強抗原特異性體液和細胞免疫反應(yīng)；相比于非靶向 DNA疫苗，其抗體滴度增強了2.5倍，細胞免疫反應(yīng)也有較大程度的增強。抗體亞型測定的結(jié)果表明該DNA疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了以IgG1為主的抗體，即免疫反應(yīng)以Th2型免疫應(yīng)答途徑為主。

7、保護性試驗結(jié)果證明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能夠刺激機體產(chǎn)生強的保護性免疫反應(yīng)，30μg劑量免疫兩次之后即能對103 LD50的A型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護作用，而pVAX1-SAHc疫苗僅為12.5％的保護效率；三次免疫之后對104 LD50的A型肉毒毒素具有87.5%的保護效率，pVAX1-SAHc疫苗僅為12.5%的保護效率，這些結(jié)果表明 pVAX1-scDEC-AHc DNA疫苗相對于pVAX1-SAHc疫苗具有更高的

8、保護效率。通過脾細胞流式分析和免疫注射部位肌肉組織免疫組化實驗研究了該 DNA疫苗的 DCs靶向效應(yīng)，結(jié)果表明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能夠在免疫注射部位募集更多的DCs，促進其成熟，并且能夠高效地促進免疫器官中的DCs進行增殖和成熟，這些結(jié)果提示該DNA疫苗能夠增強免疫反應(yīng)可能要歸功于這種DCs靶向作用。
　　本研究工作還對原核表達的可溶性B型肉毒毒素重組亞單位疫苗的免疫原性進行了研究。本實驗將B型肉毒毒素受體結(jié)合

9、區(qū)Hc段基因克隆到pTIG-Trx原核表達載體，利用大腸桿菌BL21(DE3)菌株實現(xiàn)了BHc的可溶性表達，破菌上清用HisTrapTM HP蛋白純化柱和CaptoTM MMC層析柱進行純化，純化到了純度較高的帶His標簽的和無His標簽的BHc抗原。免疫小鼠研究該大腸桿菌表達的重組BHc的免疫原性和保護效果，結(jié)果表明1μg該重組BHc單劑量免疫小鼠就能對103 LD50的B型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護作用，兩次免疫則可以對104 LD50的

10、B型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護作用。測定BHc-His免疫的小鼠血清中特異性抗體滴度平均可以達到1:110000，血清中和效價可以達到3.33 IU/ml；BHc免疫的小鼠血清中特異性抗體滴度平均可以達到1:70000，血清中和效價可以達到2.33 IU/ml；而酵母表達的mBHc免疫組僅為1:40000和1.25 IU/ml；這些結(jié)果表明大腸桿菌表達的重組BHc-His抗原具有良好的免疫原性和保護效果。此外，對于沒有His標簽的BHc抗原的

11、免疫原性研究結(jié)果表明其同樣具有很好的保護效果，可以作為候選的B型肉毒毒素重組亞單位疫苗進行下一步研究與開發(fā)。
　　總結(jié)以上研究結(jié)果，在A型肉毒毒素Hc靶向DCs的DNA疫苗研究中證明了通過DEC205受體將抗原靶向到DCs的策略確實能夠增強融合抗原免疫后的體液和細胞免疫反應(yīng)，為增強 DNA疫苗的免疫原性提供了一個新思路，并為其他型肉毒毒素或者其他病原體 DNA疫苗的研究提供了新的技術(shù)平臺。B型肉毒毒素重組亞單位疫苗的研究結(jié)果表明大