尋常型銀屑病與IL-20、IL-20受體、IL-15相關(guān)性的研究.pdf

1、目的:尋常型銀屑病(PV)是一種常見的病因不明的炎性增生性皮膚病，皮損變化早期表現(xiàn)有以巨嗜細(xì)胞和T細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤。激活的T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可直接或間接調(diào)節(jié)角朊細(xì)胞的分化、生長和功能。 IL-20和IL-15主要由外周血單個(gè)核細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分泌產(chǎn)生。用多種不同組織特異性啟動(dòng)子將人或鼠的IL-20基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)均能使轉(zhuǎn)基因鼠的IL-20表達(dá)增高，且與銀屑病患者的皮膚病理改變極為相似。IL-20的高表達(dá)可能改變了表皮細(xì)胞、淋巴細(xì)

2、胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增生和分化失調(diào)。通過對(duì)銀屑病患者皮損中IL-20和IL-15表達(dá)相關(guān)性的研究，可以進(jìn)一步證實(shí)IL-20和IL-15在銀屑病發(fā)病過程中所起的作用。
　　 材料和方法:
　　 一、研究對(duì)象
　　 收集本院2003至2005年尋常型銀屑病35例，并經(jīng)臨床及病理證實(shí)。其中男21例，女14例，平均年齡38.3(17-55)歲。正常皮膚20例(為急性外傷手術(shù)病例)，男12例，女

3、8例，平均年齡44.8(22-60)歲。于局麻下取病損活組織，深達(dá)皮下。所有標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片。
　　 二、原位雜交檢測
　　 1.操作步驟
　　 (1)玻片的處理：洗液浸泡后，用水洗凈、晾干，經(jīng)高溫、高壓滅菌。采用多聚賴氨酸處理，將載玻片于PLL工作液中上下蘸幾下，分開豎立于玻片架上，室溫晾干，4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 (2)切片制備：常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。厚度6μm，連續(xù)切片。

4、r>　　 (3)切片常規(guī)脫蠟至水，用新鮮配制的3％H2O2室溫處理10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗滌3min×3次。
　　 (4)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃消化15min。0.5moL/LPBS洗5min×3次，蒸餾水洗5min×1次。
　　 (5)預(yù)雜交：按每張切片加20μl預(yù)雜交液，濕盒中于恒溫箱38℃4h。吸取多余液體

5、，不洗。
　　 (6)雜交：按每張切片加20μl雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開，蓋在切片上，恒溫箱42℃雜交過夜。
　　 (7)雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×2次；0.5×SSC15min×1次；0.2×SSC15min×2次。
　　 (8)滴加封閉液：37℃30min。甩去多余液體，不洗。
　　 (9)滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60min。0.5 moL/

6、L PBS洗5min×4次。
　　 (10)滴加鏈霉親合素生物素復(fù)合體(SABC)：37℃20min。0.5 mol/LPBS洗5min×3次。
　　 (11)滴加生物素化過氧化物酶：37℃20min。0.5 moL/L PBS洗5min×4次。
　　 (12)DAB顯色：室溫20～30min。用蒸餾水充分洗滌，蘇木素復(fù)染，充分水洗。
　　 (13)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
　　 2.

7、質(zhì)量控制
　　 (1)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照：
　　 陽性對(duì)照：由公司提供；
　　 陰性對(duì)照：為同一標(biāo)本的切片省略探針。
　　 (2)操作中嚴(yán)格防止RNA酶的污染。
　　 結(jié)果
　　 一、陽性對(duì)照：細(xì)胞胞漿明顯棕色著色。
　　 二、陰性對(duì)照：均無胞漿特異性染色出現(xiàn)。
　　 三、標(biāo)本檢測結(jié)果：
　　 (一)IL-20 mRNA在正常皮膚和尋常型銀屑病組織中表達(dá)
　　

8、 1.IL-20 mRNA在銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽性～強(qiáng)陽性(++～+++)表達(dá)，主要在表皮基底層形成細(xì)胞胞漿陽性著色，陽性率為100％，其中強(qiáng)陽性為62.8％(22/35)、較強(qiáng)陽性為34.3％(12/35)、陽性為2.8％(1/35)(見表1)。
　　 2.在正常皮膚組織中，IL-20 mRNA在表皮基底層無陽性著色的18例，有陽性著色的2例，陽性率為10.0％，且呈(-～+)。經(jīng)t檢驗(yàn)，二組間有顯著性差異。

9、r>　　 3.在正常皮膚和尋常型銀屑病皮膚組織中IL-20 mRNA表達(dá)線性密度的比較：在尋常型銀屑病皮膚組織IL-20 mRNA表達(dá)線性密度為13.502±9.613，明顯高于IL-20 mRNA在正常皮膚組織中的表達(dá)(1.512±1.503)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (二)IL-20R mRNA在正常皮膚和尋常型銀屑病組織中表達(dá)
　　 1.IL-20受體mRNA在銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽性～強(qiáng)陽性(++～

10、+++)表達(dá)，主要在表皮基底層形成細(xì)胞胞漿陽性著色，其中強(qiáng)陽性為55.6％(19/35)、較強(qiáng)陽性為47.3％(16/35)(見表2)。
　　 2.在正常皮膚組織中，IL-20受體mRNA在表皮基底層無陽性著色的18例，有陽性著色的2例，陽性率為10.0％，且呈(-～+)。經(jīng)t檢驗(yàn)，二組間有顯著性差異。
　　 3.在正常皮膚和尋常型銀屑病皮膚組織中IL-20R mRNA表達(dá)線性密度的比較：在尋常型銀屑病皮膚組織IL-20

11、R mRNA表達(dá)線性密度為11.540+8.493，高于IL-20R mRNA在正常皮膚組織中的表達(dá)(1.362±1.406)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (三)IL-15 mRNA在正常皮膚和尋常型銀屑病組織中表達(dá)
　　 1.在正常皮膚組織中，IL-15 mRNA在表皮基底層無陽性著色的17例，有陽性著色的3例，陽性率為15.0％，且呈(-～+)。
　　 2.在尋常型銀屑病皮膚組織中，IL-15 mRNA主要在表

12、皮基底層形成細(xì)胞胞漿陽性著色，陽性率為100％，且大部分呈(++～+++)。其中強(qiáng)陽性為57.1％(20/35)、較強(qiáng)陽性為31.4％(11/35)、陽性為11.4％(4/35)(見表3)。經(jīng)t檢驗(yàn)，二組間有顯著性差異。
　　 3.在正常皮膚和尋常型銀屑病皮膚組織中IL-15 mRNA表達(dá)線性密度的比較：線性密度用陽性細(xì)胞數(shù)/mm來表示，在尋常型銀屑病皮膚組織IL-15 mRNA表達(dá)線性密度為9.512±6.503，高于IL-1