山羊IL-15的克隆、表達(dá)分析及豬IL-15對(duì)胎盤性狀的影響.pdf

1、白細(xì)胞介素15(Interleukin-15，IL-15)是一種多功能細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)和非免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。在免疫系統(tǒng)中，參與免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)，包括刺激NK細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞的產(chǎn)生、激活;在非免疫系統(tǒng)中，可引起肌肉萎縮性刺激和肌肉收縮性反應(yīng)，因其在骨骼肌中表達(dá)尤為豐富，而且在運(yùn)動(dòng)的肌肉中表達(dá)量有上升的趨勢(shì)，被認(rèn)為是一種重要的肌肉內(nèi)分泌因子，或稱為肌因子(myokine)。又因其毒性小，易吸收等特點(diǎn)，亦可作為一種新型的免疫

2、佐劑而備受關(guān)注。
　　在生產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，高產(chǎn)仔的遺傳機(jī)制一直是繁殖研究過(guò)程當(dāng)中的熱點(diǎn)。胎盤作為胎兒成長(zhǎng)的臨時(shí)器官，對(duì)其生長(zhǎng)有重要的影響。在通過(guò)表型選擇來(lái)提高產(chǎn)仔數(shù)未獲得很大進(jìn)展的情況下，胎盤效率（placental efficiency，PE）作為產(chǎn)仔數(shù)育種的一種重要指標(biāo)越來(lái)越受到重視。
　　本研究首先以山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，根據(jù)山羊IL-15基因預(yù)測(cè)的mRNA序列(XM_005691220)設(shè)計(jì)并合成特異性引物。運(yùn)用RT-pCR

3、方法對(duì)山羊IL-15開放閱讀框(ORF)進(jìn)行克隆，擴(kuò)增，鑒定及生物信息學(xué)分析;獲得的成熟肽段與pET-32a(+)連接，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)并運(yùn)用Western blot方法驗(yàn)證。
　　再次基礎(chǔ)上，運(yùn)用qPCR檢測(cè)了心、肝、脾、肺、腎、大腦、垂體、肌肉、膀胱、脂肪、胃、胎盤、小腸和下丘腦等14個(gè)組織在初生時(shí)期，2月齡的梅山豬、杜洛克豬中表達(dá)情況并在山羊組織中進(jìn)一步驗(yàn)證;進(jìn)一步以榮昌豬為研究對(duì)象，采用現(xiàn)場(chǎng)接產(chǎn)的方法

4、對(duì)豬胎盤的相關(guān)性狀進(jìn)行直接測(cè)定，比較不同胎盤效率組的差異;采用直接測(cè)序的方式，通過(guò)對(duì)不同個(gè)體的基因序列比對(duì)，篩選IL-15基因部分片段多態(tài)性位點(diǎn);利用最小二乘法進(jìn)行方差分析不同基因型間的胎盤性狀、繁殖性狀的差異。本研究為以后研究其生物學(xué)功能提供相關(guān)數(shù)據(jù)。
　　1.運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增山羊IL-15 ORF，序列分析顯示，山羊IL-15共包含486 bp全長(zhǎng)編碼序列，可編碼162個(gè)氨基酸，能夠形成4-α-螺旋結(jié)構(gòu)，同源性比對(duì)分析

5、發(fā)現(xiàn)，其核苷酸和氨基酸序列與綿羊(97.55％、94.48％)和牛(95.91％、92.02％)的同源性最高，與雞的同源性最低(48.59％、27.89％)。
　　2.通過(guò)PCR方法獲得缺失48個(gè)氨基酸長(zhǎng)信號(hào)肽的成熟肽序列，與原核表達(dá)載體pET32a(+)構(gòu)建重組表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，獲得29 kDa的融合蛋白，并使用Western blot方法進(jìn)行鑒定。
　　3.通過(guò)qPCR方法，采用2-ΔΔ Ct

6、的方法構(gòu)建IL-15基因的組織表達(dá)譜。結(jié)果表明，IL-15基因在山羊和豬所檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，該基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異(p＜0.05)，其中在肌肉、脾和胎盤中IL-15的相對(duì)表達(dá)量最高，在大腦中的表達(dá)量最低。
　　4.榮昌豬平均胎盤效率為5.71±0.84g(n=30)，平均窩重為912.27±138.76g(n=30)，產(chǎn)仔數(shù)量為9.00±1.96頭(n=30);不同個(gè)體間的胎盤效率差異極顯著(p＜0.01

7、)。通過(guò)比較榮昌豬高、中、低胎盤效率組產(chǎn)仔數(shù)量、初生窩重、平均初生重的差異，表明胎盤效率和產(chǎn)仔數(shù)量、初生窩重呈正相關(guān)，而且榮昌豬胎盤高效率組產(chǎn)仔數(shù)量極顯著高于中低胎盤效率組分別高出2.6頭和4頭(p＜0.01)。
　　5.經(jīng)測(cè)序分析得出，榮昌豬IL-15外顯子4未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，內(nèi)含子3存在2個(gè)SNP位點(diǎn)，出現(xiàn)AA、AB基因型和AA、BB基因型。對(duì)IL-15基因兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與對(duì)應(yīng)母豬的胎盤效率、繁殖性能分別做相關(guān)性分析，結(jié)果表