Il-15基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 利用小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型，應(yīng)用白細(xì)胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)表達(dá)質(zhì)粒pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)對(duì)小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移進(jìn)行基因治療，觀察其在控制腫瘤生長、延長患癌動(dòng)物生存期、延緩腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，分析腹腔免疫細(xì)胞變化，探討IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的可能機(jī)制，為IL-15為基礎(chǔ)的腫瘤免疫基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)首先通過腹腔注射小鼠

2、結(jié)腸癌細(xì)胞CT26，建立小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌的模型，然后將表達(dá)綠色熒光蛋白載體pHi2-EGFP-CMV-TAT(L6)注射于已建模小鼠腹腔，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，評(píng)估轉(zhuǎn)染情況與目的基因的表達(dá)效率。
　　 進(jìn)一步利用小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型，腹腔注射表達(dá)IL-15的質(zhì)粒pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)為治療組;腹腔注射空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS(M7)、腹腔注射P

3、BS、腹腔不注射治療作為對(duì)照組;無腫瘤組作為空白組。評(píng)估不同治療方式下對(duì)荷瘤小鼠腫瘤大小、體重、腹水形成、生存期的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)，分析不同治療組荷瘤小鼠腹水中CD4、CD8、CD25、NKG2D、CD11b的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.荷瘤小鼠腹腔注射能表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)粒L6，活體成像顯示小鼠腹腔有綠色熒光蛋白表達(dá)。
　　 2.腫瘤對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤未治療組）7周內(nèi)荷瘤小鼠大部分死亡，期間

4、體重增加迅速，剖檢均可見腹水和腹腔內(nèi)廣泛腫瘤種植;治療組（L3組）中多數(shù)小鼠生存時(shí)間延長，體重增加緩慢。
　　 3.治療組（L3組）荷瘤小鼠的生存期延長，與其它各組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 4.治療組（L3組）CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值分別在第1周和第2周與對(duì)照組(M7組、PBS組、腫瘤未治療組)、空白組（無腫瘤組）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，治療組的值高于對(duì)照組與空白組。
　　 治療組

5、（L3組）CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值在第1周與對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤未治療組）、空白組（無腫瘤組）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，治療組的值高于對(duì)照組、空白組。在第2周時(shí)，治療組(L3組)CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值與對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤未治療組）、空白組（無腫瘤組）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 治療組（L3組）CD8+/CD4+細(xì)胞比值分別在第1周和第2周與對(duì)照組(M7組、PBS組、腫瘤未治療組)、空白組

6、（無腫瘤組）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 治療組（L3組）CD4+CD25+T細(xì)胞絕對(duì)值在第1周與對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤未治療組）、空白組（無腫瘤組）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，治療組的值低于對(duì)照組。第2周治療組（L3組）CD25+CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值與對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤未治療組）、空白組（無腫瘤組）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 治療組（L3組）CD11b+巨噬細(xì)胞

7、絕對(duì)值分別在第1周與第2周與對(duì)照組(M7組、PBS組、腫瘤未治療組)、空白組（無腫瘤組）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，治療組的值高于對(duì)照組與空白組。
　　 治療組（L3組）NKG2D+NK細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞比例分別在第1周和第2周與對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤未治療組）、空白組（無腫瘤組）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 治療組（L3組）腹腔細(xì)胞總數(shù)分別在第1周與第2周與對(duì)照組（M7組、PBS組、腫瘤

8、未治療組）、空白組（無腫瘤組）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組的值高于對(duì)照組。
　　 5.治療組（L3組）在第1周，CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值、CD25+CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值、CD11b+巨噬細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞比例、細(xì)胞總數(shù)與第2周比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);淋巴細(xì)胞比例、CD4+CD25+T細(xì)胞絕對(duì)值第1周少于第2周，而CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值、CD11b+巨噬細(xì)胞絕對(duì)值、細(xì)胞總數(shù)第1周多于第2周。另外CD4+T

9、細(xì)胞絕對(duì)值、CD8+/CD4+細(xì)胞比值、NKG2D+NK細(xì)胞絕對(duì)值則第1周與第2周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.腹腔注射質(zhì)粒載體可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染，表達(dá)目的基因。
　　 2.pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)腹腔基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移腫瘤，可以顯著延緩腫瘤的生長速度，延長荷瘤小鼠生存期。
　　 3.pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)腹腔基因治療可增強(qiáng)

10、荷瘤小鼠的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，其機(jī)制是通過提高CD4+輔助性T細(xì)胞，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞腹腔浸潤，抑制CD4+CD25+T細(xì)胞增殖，增加腹腔CD11b+巨噬細(xì)胞表達(dá)，提示IL-15通過提高機(jī)體的自身免疫系統(tǒng)，增加機(jī)體的獲得性免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，抑制腫瘤生長。
　　 4.pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)腹腔基因治療未增加NKG2D+NK細(xì)胞的表達(dá)，提示本模型系統(tǒng)中，IL-15未通過增加NKG2D+NK細(xì)胞的浸潤發(fā)