Kupffer細(xì)胞和IL-15對(duì)HBV免疫耐受的作用機(jī)制研究.pdf

1、肝臟是一個(gè)獨(dú)特的器官，它既是人體最大的代謝和解毒器官，同時(shí)也被認(rèn)為是機(jī)體重要的免疫器官。與其它免疫器官主要誘導(dǎo)免疫應(yīng)答不同，肝臟更傾向于誘導(dǎo)免疫耐受如口服免疫耐受，肝臟移植耐受等。一些病原菌如乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)和瘧疾等利用肝臟誘導(dǎo)免疫耐受的特性在肝臟局部形成慢性感染，嚴(yán)重危害人類健康。
　　HBV主要感染肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，部分人群感染HB

2、V后會(huì)導(dǎo)致終生攜帶，HBV攜帶者對(duì)HBV疫苗處于免疫耐受狀態(tài)。長(zhǎng)期以來，人們對(duì)于HBV誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)理研究主要基于HBV轉(zhuǎn)基因鼠，但HBV轉(zhuǎn)基因鼠免疫系統(tǒng)從胚胎期對(duì)HBV病毒就完全處于免疫耐受狀態(tài)，與人類后天感染HBV狀態(tài)有較大差別。本研究中我們采用pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射的方式建立HBV慢性攜帶小鼠動(dòng)物模型，研究了HBV慢性攜帶誘導(dǎo)外周免疫耐受的機(jī)理和HBV感染初期肝臟局部微環(huán)境改變對(duì)HBV免疫耐受的影響。一方面，我們發(fā)現(xiàn)

3、Kupffer細(xì)胞在誘導(dǎo)HBV攜帶鼠外周免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用;另一方面，肝臟過表達(dá)IL-15能夠預(yù)防pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射形成的免疫耐受狀態(tài)。
　　本研究中，我們采用對(duì)C57BL/6小鼠高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒的方式建立HBV持續(xù)攜帶動(dòng)物模型，模擬人類HBV慢性感染狀態(tài)。運(yùn)用放射免疫方法定量檢測(cè)血清中HBsAg、HBeAg、Anti-HBs含量，免疫組化方法檢測(cè)肝臟組織HBcAg表達(dá)，熒光定量PCR方法

4、檢測(cè)血清中HBV DNA含量，利用以上指標(biāo)評(píng)價(jià)pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射后HBV攜帶情況;通過細(xì)胞清除、細(xì)胞純化和細(xì)胞轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)觀察特定細(xì)胞亞群在HBV誘導(dǎo)外周免疫耐受過程中的作用;采用構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和高壓注射的方式在小鼠體內(nèi)內(nèi)源性過表達(dá)IL-15;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞亞群的變化特征;利用ELISA方法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子含量的變化。采用上述研究方法，我們得到了以下結(jié)果:
　　1、Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)HBV免疫耐受

5、r>　　pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射小鼠后血清中能檢測(cè)到HBsAg、HBeAg持續(xù)表達(dá)，高壓注射6周后肝臟組織仍可以檢測(cè)到HBcAg蛋白，血清轉(zhuǎn)氨酶在HBV質(zhì)粒攜帶過程中一直維持在正常水平，這暗示HBV質(zhì)粒攜帶鼠的免疫狀態(tài)與處于免疫耐受狀態(tài)的人類慢性HBV攜帶者的免疫狀態(tài)相似。與人類HBV感染現(xiàn)象相一致，我們發(fā)現(xiàn)HBV疫苗預(yù)先免疫可以促進(jìn)小鼠排斥HBV;HBV質(zhì)粒攜帶鼠在HBV疫苗免疫后，不能產(chǎn)生Anti-HBs，HBV疫苗免疫也

6、不能促進(jìn)HBV質(zhì)粒攜帶鼠排斥HBV，這表明肝臟表達(dá)HBV誘導(dǎo)外周對(duì)HBV疫苗處于免疫耐受狀態(tài)。進(jìn)一步我們對(duì)HBV質(zhì)粒攜帶鼠免疫非HBV蛋白抗原OVA，發(fā)現(xiàn)HBV攜帶鼠可以對(duì)OVA產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這說明肝臟表達(dá)HBV誘導(dǎo)外周免疫耐受只針對(duì)HBV蛋白，是抗原特異性的。
　　我們將HBV質(zhì)粒攜帶鼠和對(duì)照鼠的脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)将@得性免疫系統(tǒng)缺陷的Rag1-/-鼠中，在Rag1-/-鼠上分別重建它們的外周免疫系統(tǒng)，觀察重建的免疫系統(tǒng)對(duì)HBV疫

7、苗的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重建了對(duì)照鼠免疫系統(tǒng)的Rag1-/-鼠能對(duì)HBV疫苗產(chǎn)生應(yīng)答，而重建了HBV攜帶鼠免疫系統(tǒng)的Rag1-/-鼠不能對(duì)HBV疫苗產(chǎn)生應(yīng)答。接著，我們將HBV攜帶鼠脾臟淋巴細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞替換為對(duì)照鼠的CD4+T細(xì)胞，再轉(zhuǎn)輸給Rag1-/-鼠，發(fā)現(xiàn)對(duì)照鼠的CD4+T細(xì)胞能輔助HBV攜帶鼠的獲得性免疫系統(tǒng)對(duì)HBV疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這暗示HBV攜帶鼠免疫耐受狀態(tài)可能是由于其CD4+T細(xì)胞功能缺陷造成的。
　　肝

8、臟抗原遞呈細(xì)胞被證明在誘導(dǎo)肝臟免疫耐受過程中起重要作用。HBV攜帶鼠的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)絅a(i)ve鼠中能誘導(dǎo)受者鼠對(duì)HBV疫苗低免疫應(yīng)答，進(jìn)一步將肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分為Kupffer細(xì)胞和非Kupffer細(xì)胞再分別進(jìn)行轉(zhuǎn)輸，我們發(fā)現(xiàn)Kupffer細(xì)胞具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)受者鼠低免疫應(yīng)答的能力，這表明Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)了HBV免疫耐受。不過，檢測(cè)Kupffer細(xì)胞在pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射前后的變化情況，我們發(fā)現(xiàn)Kupffer細(xì)胞的

9、狀態(tài)并沒有顯著改變，這暗示肝臟Kupffer細(xì)胞一直處于誘導(dǎo)免疫耐受的狀態(tài)。
　　2、肝臟過表達(dá)IL-15誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β預(yù)防HBV免疫耐受
　　為了研究IL-15對(duì)HBV免疫耐受的影響，我們構(gòu)建了含IL-15基因表達(dá)框的pLIVE-IL-15質(zhì)粒，通過高壓注射的方式使pLIVE-IL-15質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)過表達(dá)IL-15。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pLIVE-IL-15質(zhì)粒高壓注射小鼠后能在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)。若將pLIVE-IL-15質(zhì)粒

10、或?qū)φ召|(zhì)粒pLIVE-EGFP與pAAV/HBV1.2質(zhì)粒一起注射到小鼠體內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照質(zhì)粒組小鼠血清中長(zhǎng)期表達(dá)HBsAg和HBeAg，而pLIVE-IL-15質(zhì)粒注射組血清中低表達(dá)HBsAg和HBeAg并且HBV最終會(huì)被清除。這表明IL-15能有效預(yù)防HBV免疫耐受狀態(tài)形成。
　　IL-15是一種多能性細(xì)胞因子，對(duì)天然免疫系統(tǒng)細(xì)胞和獲得性免疫系統(tǒng)細(xì)胞都具有調(diào)節(jié)作用。pLIVE-IL-15質(zhì)粒在Rag1-/-鼠中仍能有效地抑制H

11、BV表達(dá)，這表明IL-15發(fā)揮抗HBV功能不依賴于獲得性免疫系統(tǒng)。盡管脾臟和肝臟NK細(xì)胞在IL-15質(zhì)粒注射后數(shù)目有較大提升，但采用PK136抗體清除NK/NKT細(xì)胞并不影響IL-15抗HBV功能，采用IL-2Rγc-/-鼠實(shí)驗(yàn)也表明IL-15抗HBV能力不依賴于NK細(xì)胞。
　　IFN-γ和IFN-α/β均可以抑制HBV表達(dá)。IL-15在IFN-γ缺陷鼠中仍具有抗HBV功能，這表明IL-15抗HBV能力不依賴于IFN-γ。研究發(fā)現(xiàn)

12、，肝臟IFN-βmRNA和血清IFN-β蛋白水平在IL-15質(zhì)粒注射后顯著上調(diào)，而肝臟IFN-αmRNA和血清IFN-α蛋白水平在IL-15質(zhì)粒注射后變化不明顯。進(jìn)一步采用Anti-IFNAR1抗體阻斷IFN-β功能可以完全逆轉(zhuǎn)IL-15的抗HBV作用，這說明IL-15抗HBV功能依賴于IFN-β。Clodronate Lyposomes清除巨噬細(xì)胞不會(huì)改變IL-15的抗HBV作用，暗示IFN-β并不是由IL-15作用于巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的。

13、
　　結(jié)論:pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射模型很好地模擬了人類HBV慢性感染狀況，可以用于研究HBV感染誘導(dǎo)外周免疫耐受的現(xiàn)象及機(jī)理。我們發(fā)現(xiàn)HBV免疫耐受狀態(tài)與CD4+T細(xì)胞功能缺陷相關(guān)，Kupffer細(xì)胞在誘導(dǎo)HBV免疫耐受過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞因子IL-15通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β有效預(yù)防HBV免疫耐受狀態(tài)的形成。本研究對(duì)于認(rèn)識(shí)肝臟獨(dú)特的免疫耐受特性，對(duì)于理解HBV慢性感染誘導(dǎo)外周免疫耐受的機(jī)理及HBV治療都具有一定意義