Il-20在支氣管哮喘Th2免疫應(yīng)答及氣道重塑中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　哮喘是一種發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜的常見疾病，涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞因子的共同參與，目前認(rèn)為哮喘的病理生理過程主要有氣道高反應(yīng)性，氣道炎癥，粘液細(xì)胞的過度分泌，氣道重塑等，其中氣道重塑是固定性氣流受限、肺功能受損的病理生理基礎(chǔ)。哮喘一直被認(rèn)為是Th2疾病，這種疾病是由Th2細(xì)胞因子水平升高而引起IgE和嗜酸性粒細(xì)胞增加的炎癥反應(yīng)。機(jī)體吸入致敏原后刺激機(jī)體產(chǎn)生抗原，抗原被抗原提呈細(xì)胞樹突狀細(xì)胞捕獲，隨后被提呈給輔助T(Th)細(xì)胞

2、，激活Th2細(xì)胞擴(kuò)增，隨之Th2細(xì)胞因子如白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素13(IL-13)等產(chǎn)生并釋放從而誘發(fā)氣道炎癥。另外己知Th-17細(xì)胞、Th-19細(xì)胞及其分泌的多種炎性因子如:白介素17A(IL-17A)、白介素17F(IL-17F)、白介素22(IL-22)和白介素19(IL-19)也參與哮喘的調(diào)節(jié)。這些炎癥因子也誘導(dǎo)炎癥形成，促進(jìn)氣道平滑肌的收縮，誘發(fā)哮喘。氣道重塑是哮喘的另一重要病理生理特征，反復(fù)氣道炎

3、癥破壞氣道上皮組織，而破壞了的上皮細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，從而形成了損傷修復(fù)的循環(huán)。處于修復(fù)階段的上皮細(xì)胞產(chǎn)生促纖維介質(zhì)及炎前性細(xì)胞因子。促纖維介質(zhì)包括生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、纖維生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素，這些促纖維介質(zhì)可調(diào)節(jié)纖維母細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞分泌膠原、彈性纖維、蛋白多糖、糖蛋白，從而引起氣道壁增厚。肌成纖維細(xì)胞分泌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ膠原蛋白、纖連蛋白(FN)、細(xì)胞粘合素也促進(jìn)氣道壁的增厚。TGF-β1介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithel

4、ial to mesenchymaltransition，EMT)，通過EMT促進(jìn)氣道重塑的發(fā)展，在這一過程中嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞也起重要作用。促炎性細(xì)胞因子白介素25(IL-25)、白介素33(IL-33)等刺激基質(zhì)增殖導(dǎo)致也加重了氣道重塑的形成，氣道重塑過程中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和膠原表達(dá)增加，其中FN、α-SMA被看做是氣道重塑的標(biāo)記。
　　根據(jù)國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域的研究，目前仍未解決的問題有:(1)IL-20及其受體

5、是否在支氣管哮喘氣道上皮中表達(dá)增高，是否與哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān);(2)IL-20的表達(dá)是否與支氣管哮喘的Th2免疫應(yīng)答有關(guān);(3)IL-20在支氣管哮喘氣道重塑中是否發(fā)揮作用。
　　研究目的：
　　1.明確IL-20及其受體在支氣管哮喘上皮細(xì)胞及肺泡灌洗液中的表達(dá)水平，以及其表達(dá)水平是否與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān);
　　2.探討IL-20在支氣管哮喘中的作用及IL-20與Th2免疫應(yīng)答的相關(guān)性;
　　3.探討IL-20在支

6、氣管哮喘氣道重塑中是否發(fā)揮促進(jìn)氣道重塑的作用。
　　研究方法
　　1.首先為了明確IL-20及其受體在氣道上皮是否高水平表達(dá)，我們從支氣管哮喘患者(n=20)和正常人(n=20)分別獲取支氣管鏡活檢標(biāo)本，并用特異性抗體分別對(duì)IL-20、IL-20受體1(IL-20R1)、IL-20受體2(IL-20R2)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。
　　2.其次為了研究IL-20在支氣管哮喘中與Th2免疫應(yīng)答的關(guān)系，首先我們采集哮喘患者(n

7、=100)和正常人(n=100)靜脈血血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)受試者血清中IL-20與IL-4、 IL-5、IL-13的水平，并分別進(jìn)行IL-20與IL-4、IL-5、IL-13的相關(guān)性分析，同時(shí)，我們將哮喘患者分為輕、中、重三組，分析三組患者血清中IL-20表達(dá)水平是否有差異，以明確IL-20的表達(dá)水平是否與哮喘嚴(yán)重程度有關(guān)。
　　3.再次我們采用蘇木精-伊紅染色法(HE)染色觀察支氣管哮喘患者氣道黏膜上皮

8、的氣道重塑情況。為了明確IL-20在支氣管哮喘氣道重塑中的作用，我們首先將20只BALB/c小鼠隨機(jī)分為雞卵白蛋白(OVA)組和對(duì)照組，每組10只，OVA組制作小鼠哮喘模型，取兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，應(yīng)用ELISA檢測(cè)BALF中IL-20表達(dá)水平，然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)哮喘模型小鼠氣道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、纖連蛋白-1(FN-1)的在氣道上皮的表達(dá)水平

9、。為明確哮喘模型小鼠肺組織中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1是否高于正常對(duì)照組，我們應(yīng)用western blot方法對(duì)哮喘模型小鼠肺組織在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表達(dá)情況。為進(jìn)一步明確IL-20與α-SMA、FN-1有無(wú)直接關(guān)系，我們采用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外試驗(yàn)，采用小鼠肺上皮細(xì)胞-12(MLE-12)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用IL-20處理MLE-12細(xì)胞

10、，IL-20濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0ng/ml，應(yīng)用westem blot方法檢測(cè)各濃度IL-20處理后的α-SMA、FN-1表達(dá)水平，并應(yīng)用western blot方法檢測(cè)1.5ng/ml濃度的IL-20處理MLE-12細(xì)胞0、6、12、24h時(shí)α-SMA、FN-1以確定α-SMA、FN-1與IL-20有無(wú)劑量、時(shí)間依賴性，為進(jìn)一步確定IL-20與α-SMA、FN-1之間有無(wú)因果關(guān)系，我們應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，采用IL-2

11、0-shRNA轉(zhuǎn)染MLE-12沉默IL-20的表達(dá)，采用westem blot方法檢測(cè)IL-20、α-SMA、FN-1表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.首先通過對(duì)哮喘患者氣道黏膜活檢組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的方法，我們發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者氣道粘膜上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（分別為:P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.通過ELSIA方法檢

12、測(cè)我們檢測(cè)支氣管哮喘患者及健康對(duì)照血清中IL-20與IL-4、IL-5、IL-13，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者血清中IL-20與IL-4、IL-5、 IL-13具明顯高于健康對(duì)照組（分別為:P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），同時(shí)我們將IL-20水平與IL-4、IL-5、IL-13水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-20水平的升高與IL-4、 IL-5、IL-13水平的升高具有顯著的正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R2分別為

13、:0.809，0.783，0.752）。我們將100名哮喘患者分為輕、中、重三組，分析這三組患者血清中IL-20的水平有無(wú)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著患者病情嚴(yán)重程度的加重，患者血清中IL-20的水平逐漸升高，且三組中IL-20的表達(dá)水平與對(duì)照組及相互之間有明顯差異（分別為: P＜0.01，P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）。
　　3.通過HE染色，我們?cè)谙颊邭獾勒衬ど掀ぶ邪l(fā)現(xiàn)了明顯的氣道重塑的病理表現(xiàn)。在小鼠BALF的研究中，

14、我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠BALF相比，哮喘模型小鼠BALF中IL-20的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色染色發(fā)現(xiàn)哮喘模型小鼠氣道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（分別為:P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。通過western blot方法進(jìn)一步確定了哮喘模型小鼠肺組織中IL-20、IL-20R1、IL-20

15、R2、α-SMA、FN-1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（分別為:P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-20處理MLE-12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)α-SMA、FN-1的表達(dá)水平明顯上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)α-SMA、FN-1的表達(dá)水平隨IL-20的濃度的增加而明顯上調(diào)，IL-20在1.5ng/ml濃度與MLE-12細(xì)胞共育6小時(shí)后，α-SMA、FN-1表達(dá)水平升高。應(yīng)用IL-20-shRNA沉默IL-20的表

16、達(dá)，再次應(yīng)用western blot檢測(cè)α-SMA、FN-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SMA、FN-1的表達(dá)水平被明顯抑制了。
　　研究結(jié)論：
　　1.支氣管哮喘患者氣道黏膜上皮IL-20、IL-20R1、IL-20R2高表達(dá)。哮喘模型小鼠BALF中高表達(dá)IL-20。
　　2.哮喘患者血清中高表達(dá)IL-20與IL-4、IL-5、IL-13，且IL-20的升高與IL-4、IL-5、IL-13的升高呈正相關(guān)。說明IL-20與Th2免疫

17、應(yīng)答存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。
　　3.支氣管哮喘模型小鼠肺組織及氣道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、 FN-1高表達(dá)及HE染色均支持哮喘氣道上皮存在氣道重塑。應(yīng)用westem blot方法進(jìn)一步確定鼠肺組織中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組。用IL-20處理MLE-12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)α-SMA、FN-1表達(dá)升高，并且其升高與IL-20濃度存在劑量依