支氣管哮喘患者氣道和外周血IL-25的表達水平與哮喘表型關(guān)系的研究.pdf

1、第一部分哮喘患者氣道上皮IL-25及其受體IL-17RB的表達
　　目的：檢測支氣管哮喘患者纖支鏡氣道上皮刷片細胞及氣道活檢組織中IL-25及其受體IL-17RB的mRNA水平和蛋白表達情況，探索IL-25及其受體IL-17RB的表達部位。
　　方法：我們選取43例支氣管哮喘患者及21例健康對照者作為研究對象，首先統(tǒng)計納入研究的研究對象的一般特征資料，記錄所有受試者的肺功能測量指標 FEV1％預計值和PD20值（引起通氣功能

2、指標FEV1下降20%時的激發(fā)劑累積劑量）、外周血總IgE含量及外周血中嗜酸性粒細胞數(shù)目。隨后，我們通過纖維支氣管鏡檢查對所有受試者進行氣道上皮細胞刷片及氣道組織活檢，使用實時熒光定量PCR（real-time PCR）方法檢測氣道上皮刷片細胞中IL-25及氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA表達水平，利用活檢組織切片進行免疫組織化學方法檢測 IL-25及其受體 IL-17RB的蛋白表達情況，并且在顯微鏡下計數(shù)免疫組織化學染色的切片中

3、IL-25及其受體IL-17RB染色陽性的細胞數(shù)目。通過相關(guān)性分析評價氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA水平與氣道活檢組織中 IL-17RB的 mRNA水平之間的相關(guān)關(guān)系、氣道上皮刷片細胞中 IL-25的mRNA水平與IL-25染色陽性的細胞數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，以及IL-25染色陽性的細胞數(shù)與IL-17RB染色陽性細胞數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)果：支氣管哮喘患者的肺功能FEV1%預計值和PD20值顯著低于健康對照者。而外周血總I

4、gE含量及外周血中嗜酸性粒細胞數(shù)目則明顯高于健康對照者，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.0001）。同時，real-time PCR方法檢測氣道上皮刷片細胞中IL-25及氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA表達水平的結(jié)果顯示：支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細胞中 IL-25的 mRNA表達水平明顯高于正常對照者，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.0001）；且氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA表達水平也明顯高于正常對照者，差異有統(tǒng)計學意義

5、（P=0.027）。此外，通過免疫組織化學方法，我們看到，IL-25及其受體IL-17RB染色陽性的細胞主要是氣道上皮細胞，且支氣管哮喘患者的組織切片中IL-25及其受體IL-17RB染色陽性的細胞數(shù)目明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002和P<0.0001）。與正常對照者相比，支氣管哮喘患者的氣道上皮細胞及杯狀細胞內(nèi)，IL-25及其受體IL-17RB的蛋白表達明顯增高，棕黃色沉積明顯，尤其以IL-25的表達增高更明顯。此

6、外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示：支氣管哮喘患者氣道刷片細胞中IL-25的mRNA水平與氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.619，P<0.001)；支氣管哮喘患者氣道刷片細胞中 IL-25的mRNA水平與免疫組織化學方法中 IL-25染色陽性的細胞數(shù)目呈顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.75，P<0.0001)；且氣道活檢組織中IL-25的陽性細胞數(shù)與IL-17RB陽性細胞數(shù)也呈顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.5

7、5，P=0.0003)。
　　結(jié)論：支氣管哮喘患者的IL-25及其受體IL-17RB主要表達于氣道上皮細胞。與對照組相比，一部分哮喘患者氣道上皮細胞IL-25及其受體IL-17RB的表達明顯增加。
　　第二部分IL-25的表達水平與支氣管哮喘患者的氣道高反應(yīng)性、氣道嗜酸性粒細胞炎癥、過敏狀態(tài)、粘液分泌以及氣道重塑之間的關(guān)系
　　目的：統(tǒng)計所有納入研究的受試者的肺功能測量指標、外周血嗜酸性粒細胞數(shù)目、外周血總 IgE含量

8、、過敏原皮試情況及氣道活檢組織的基底膜厚度，檢測氣道粘液Muc5Ac和Muc5B的表達情況，觀察支氣管哮喘患者與健康對照者以及不同的支氣管哮喘患者之間上述各指標的差異，探討IL-25的表達水平與支氣管哮喘患者的氣道高反應(yīng)性、氣道嗜酸性粒細胞炎癥、過敏狀態(tài)、粘液分泌以及氣道重塑之間的關(guān)系。方法：綜合第一部分實驗結(jié)果進行分層分析，我們發(fā)現(xiàn)，僅有一部分（約50%）的支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA水平明顯升高，而另一部分哮

9、喘患者的IL-25 mRNA水平與健康對照者相比無明顯差異。因此，依據(jù)支氣管氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA表達水平，我們將哮喘患者分為“IL-25-high”和“IL-25-low”兩個亞型。同時，與氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA表達水平一致，也僅有部分哮喘患者活檢組織中 IL-17RB的mRNA水平，以及部分哮喘患者的 IL-25及其受體IL-17RB染色陽性的細胞數(shù)目顯著高于正常對照者。我們選取支氣管哮喘患者及健康對

10、照者作為研究對象，記錄所有受試者的年齡、性別、體重指數(shù)等基本信息資料。通過肺功能+激發(fā)/舒張試驗檢測所有受試者的肺通氣功能情況以及激發(fā)試驗時引起肺通氣功能指標FEV1下降20%的激發(fā)劑累積劑量（PD20）和舒張試驗時FEV1增加的量或比例。通過纖維支氣管鏡檢查獲取受試者支氣管氣道粘膜的活檢組織，進行石蠟包埋活檢組織切片，HE染色后在光鏡下進行活檢組織中嗜酸性粒細胞的計數(shù)及氣道基底膜厚度的測定。記錄研究對象外周血中嗜酸性粒細胞的數(shù)目和外周

11、血總IgE的含量。利用過敏原皮試評定測定支氣管哮喘患者和健康對照者的過敏狀態(tài)。通過 real-time PCR和雙重免疫熒光染色檢測氣道粘液Muc5Ac和Muc5B的分泌情況。
　　結(jié)果：“IL-25-high”和“IL-25-low”兩個不同亞型的支氣管哮喘患者在年齡、性別、體重指數(shù)和肺功能（FEV1%預計值）方面的比較無明顯差異，但“IL-25-high”支氣管哮喘患者的肺功能 PD20水平卻明顯低于“IL-25-low”支氣

12、管哮喘患者和正常對照者(P=0.0048)。然而，“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道活檢組織及外周血中嗜酸性粒細胞數(shù)目則明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者（P值分別為0.003和0.045，）和正常對照者，且“IL-25-high”支氣管哮喘患者外周血總IgE水平和過敏原皮試陽性的個數(shù)也均明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者（P值分別為0.001和0.018）和正常對照者。我們通過real-time PCR檢測

13、氣道刷片細胞中粘液的表達水平，結(jié)果顯示：“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道粘液 Muc5Ac的 mRNA表達水平明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者（P=0.003）和正常對照者（P<0.0001），而 Muc5B的表達卻剛好相反（P值均<0.0001）。通過雙重免疫熒光染色，我們可以看到，與正常對照者相比，“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道粘液Muc5Ac的蛋白表達明顯增高，而粘液 Muc5B低表達或不表達，而

14、“IL-25-low”哮喘患者則呈現(xiàn)完全相反的表達情況，即氣道粘液Muc5B的蛋白表達明顯增高，而粘液Muc5Ac低表達或不表達。此外，“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道活檢組織標本粘膜下的基底膜厚度明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者和正常對照者，且“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者氣道粘膜下基底膜厚度的差異有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.0006）。
　　結(jié)論：根據(jù)氣道上皮細胞 IL-25

15、的表達水平可以把哮喘患者分為“IL-25-high”和“IL-25-low”兩個亞型?！癐L-25-high”支氣管哮喘患者有更明顯的氣道高反應(yīng)性和更嚴重氣道嗜酸性粒細胞炎癥，且氣道粘液分泌明顯增多，氣道重塑情況也更顯著。
　　第三部分“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者對吸入激素治療的反應(yīng)性
　　目的：通過檢測支氣管哮喘患者外周血血漿中IL-25的含量，評價支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細胞中IL-2

16、5的mRNA表達水平與外周血血漿中IL-25的含量的相關(guān)性。然后，通過比較“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者治療前后外周血血漿中IL-25的變化水平、經(jīng)吸入激素治療后肺功能（FEV1和PD20）的改善情況以及支氣管哮喘的臨床癥狀評估狀態(tài)，探討兩種亞型的支氣管哮喘患者與吸入激素治療反應(yīng)性之間的關(guān)系，評價“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者經(jīng)吸入激素治療后的治療效果。
　　方法：選

17、取43例就診于同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科門診的支氣管哮喘患者和21例健康對照者作為研究對象，收集各研究對象的外周血血漿標本，并規(guī)律給予支氣管哮喘患者吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德（200ug/次，一天兩次）治療，療程8周。首先依據(jù)氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA表達水平將支氣管哮喘患者分為“IL-25-high”支氣管哮喘和“IL-25-low”支氣管哮喘兩個亞型，然后再以外周血血漿中IL-25的含量55pg/ml為臨界點，將>55pg

18、/ml的研究對象歸為“plasma IL-25-high”支氣管哮喘患者，≤55 pg/ml的歸為“plasma IL-25-low”支氣管哮喘患者。通過檢測不同分類及亞型的支氣管哮喘患者在吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療8周過程中外周血血漿中IL-25的變化水平以及肺功能測量指標FEV1和PD20的變化情況，了解支氣管哮喘患者氣道上皮細胞和外周血血漿中IL-25的表達水平與吸入性糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)性之間的關(guān)系。同時，通過支氣管哮喘控制測試

19、（ACT）和支氣管哮喘控制調(diào)查問卷（ACQ-5），在支氣管哮喘患者初診、治療第4周和第8周時分別進行支氣管哮喘患者的臨床癥狀評分，了解“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者在布地奈德吸入治療8周過程中支氣管哮喘臨床癥狀（喘息、呼吸困難、夜間發(fā)作次數(shù)等）的改善情況，以評價“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者對吸入性糖皮質(zhì)激素的治療效果。
　　結(jié)果：ELISA檢測結(jié)果顯示：不同的支氣管

20、哮喘患者外周血血漿中IL-25的含量有較大差異，與支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA表達相一致，僅有一部分（約50%）哮喘患者外周血血漿中IL-25的表達水平明顯升高，而另一部分哮喘患者外周血血漿中IL-25的表達水平與健康對照者相比無明顯差異，且“IL-25-high”支氣管哮喘患者的IL-25含量顯著高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者。此外，支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細胞中IL-25的mRNA表達水平與外周血

21、血漿中IL-25的含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)為0.743，P<0.0001）。基于此，我們依據(jù)外周血血漿中 IL-25的含量55pg/ml為臨界點，將支氣管哮喘患者分為“plasma IL-25-high”和“plasma IL-25-low”支氣管哮喘兩個亞型。與治療前相比，在吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療第4周時，“IL-25-high”支氣管哮喘外周血血漿中IL-25的表達水平出現(xiàn)明顯的下降趨勢，而在“IL-25-low”支氣

22、管哮喘患者外周血血漿中，這種下降趨勢卻并不明顯，甚至有個別樣本出現(xiàn)不降反升的情況。經(jīng)吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療第8周時，“IL-25-high”支氣管哮喘外周血血漿中IL-25的表達水平仍有緩慢下降趨勢。同時，在吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療第4周和第8周時，“IL-25-high”支氣管哮喘患者肺功能 FEV1和激發(fā)試驗 PD20值的增加量明顯升高，而“IL-25-low”支氣管哮喘患者的肺功能FEV1和激發(fā)試驗PD20值變化均不明顯

23、，兩組之間差異有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.001）。此外，經(jīng)過4周和8周的吸入性糖皮質(zhì)激素治療后，“plasma IL-25-high”支氣管哮喘患者肺功能 FEV1和激發(fā)試驗 PD20值的增加量明顯高于“plasma IL-25-low”支氣管哮喘患者。通過ACT和ACQ-5問卷調(diào)查，我們也看到，一部分對吸入性糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)性更敏感的“IL-25-high”支氣管哮喘患者在布地奈德吸入治療8周過程中哮喘癥狀（喘息、呼吸困難、夜間發(fā)作

24、次數(shù)等）得到明顯改善，其ACT評分較高，ACQ-5評分偏低；而“IL-25-low”支氣管哮喘患者在布地奈德吸入治療8周過程中哮喘癥狀改善并不明顯，其ACT評分較低，ACQ-5評分偏高。
　　結(jié)論：“IL-25-high”支氣管哮喘對吸入性糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)性明顯優(yōu)于“IL-25-low”支氣管哮喘。血漿中IL-25的水平與氣道上皮細胞中IL-25表達水平有顯著相關(guān)性，且吸入性糖皮質(zhì)激素的治療降低“IL-25-high”支氣管哮