抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體-PE重組免疫毒素的構(gòu)建、表達(dá)及其效應(yīng)研究.pdf

1、該研究在原有構(gòu)建的抗CD71 ScFv表達(dá)載體pUC19/119基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,5'端引入HindⅢ酶切位點(diǎn),3'端引入Xba Ⅰ酶切位點(diǎn).采用PCR方法,擴(kuò)增出ScFv基因.并將其與T載體相連.轉(zhuǎn)化大腸桿菌,陽(yáng)性菌進(jìn)行序列測(cè)定.結(jié)果所擴(kuò)增的ScFv與原McAb基因相比序列組成基本吻合.將ScFv-pGEM-T和含有PE毒素的表達(dá)載體pSW202(含有HindⅢ,XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)),用HindⅢ和Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切.挑取2株

2、陽(yáng)性菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo),誘導(dǎo)細(xì)菌經(jīng)超聲破碎及尿素等處理,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化.對(duì)初步純化的融合蛋白進(jìn)行體外效應(yīng)研究,經(jīng)間接免疫熒光法與細(xì)胞ELISA示檢測(cè),此融合蛋白能與表面表達(dá)CD71受體的細(xì)胞特異性結(jié)合,而不與CD71受體陽(yáng)性的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng).細(xì)胞ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法顯示,此融合蛋白能阻止McAb與CD71受體結(jié)合,且隨融合蛋白濃度升高,其抑制作用越強(qiáng).MTT法檢測(cè)重組毒素的細(xì)胞毒作用,結(jié)果顯示,此融合蛋白對(duì)表面CD71受全陽(yáng)性的細(xì)胞