新型的以組蛋白h139;0為骨架的靶向于egf受體的基因?qū)胂到y(tǒng)的構(gòu)建

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文新型的以組蛋白H1為骨架的靶向于EGF受體的基因?qū)胂到y(tǒng)的構(gòu)建姓名：戴菲寒申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：顧健人20020428新型的咀組蛋白H 1 0 為骨架的靶向于E G F 受體的基因?qū)胂到y(tǒng)的構(gòu)建 中文摘要融合蛋白的表達(dá)宿主菌是H M S l 7 4 ( D E 3 ) ，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)S PS e p h a r o s e 和S e p h a d e xG 一5 0 純化。所有的融合蛋白與質(zhì)粒

2、D N A 混合后，都能阻滯D N A 在1 ％瓊脂糖凝膠中的遷移，電泳結(jié)果表明融合蛋白具有結(jié)合D N A 的能力。D N A 與蛋白結(jié)合的最佳質(zhì)量比為1 ：3 。我們采用了經(jīng)免疫組化鑒定表達(dá)E G F 受體的S K O V 3 裸鼠皮下移植瘤、B E L 一7 4 0 2 細(xì)胞株、B E L 一7 4 0 2 裸鼠皮下移植瘤作為靶細(xì)胞、組織以檢測(cè)融合蛋白的生物學(xué)活性。U 2 0 S 細(xì)胞表面未檢測(cè)出E G F 受體的表達(dá)，作為導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)

3、的陰性對(duì)照。體外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)表明，只有2 種蛋白組合( G E 7 一h i s t o n e —H A 2 0 ／H i s t o n e ．G E 7 ，H i s t o n e - G E 7 ／H i s t o n e ．H A 2 0 ) 能將D —g a l 基因?qū)氡磉_(dá)E G F 受體的細(xì)胞，其他組合或單獨(dú)的蛋白均不能將D N A 靶向性地導(dǎo)入E G F 受體高表達(dá)的細(xì)胞。體內(nèi)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)表明，未連接G E 7 或H A

4、2 0的組蛋白不能將D N A 靶向性地導(dǎo)入細(xì)胞，單獨(dú)H i s t o n e —H A 2 0 也是同樣的結(jié)果：?jiǎn)为?dú)的H i s t o n e —G E 7 ，G E 7 - h i s t o n e —H A 2 0 ，H A 2 0 一h i s t o n e —G E 7 組的腫瘤中僅檢測(cè)出少量6 ．g a l基因的表達(dá)；將H i s t o n e ．G E 7 和H i s t o n e ．H A 2 0 等量混合

5、后，p —g a l 基因的表達(dá)有所增加：G E 7 ．h i s t o n e ．H A 2 0 和H i s t o n e ．G E 7 等量混合后，S K O V 3 和B E L 一7 4 0 2 腫瘤中可檢測(cè)到大量p —g a l 基因的表達(dá)。體外導(dǎo)入篩選實(shí)驗(yàn)表明，H i s t o n e 盯．1 9 3 為骨架的基因?qū)胂到y(tǒng)活性不如H i s t o n e 全長(zhǎng)。G E 7 - h i s t o n e —H A

6、2 0 ／H i s t o n e ．G E 7 蛋白組合是經(jīng)體內(nèi)外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)篩選獲得的最佳基因?qū)胂到y(tǒng)。我們同時(shí)研究了G E 7 - h i s t o n e ．H A 2 0 ／H i s t o n e 。G E 7 蛋白組合介導(dǎo)的D —g a l 基因在腫瘤組織中的表達(dá)隨時(shí)間推移的變化：在皮下瘤周注射后1 2 小時(shí)，就有p ．g a l 基因的表達(dá)，2 4 小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，4 8 小時(shí)開始下降，9 6 小時(shí)、7 天、1 0

7、天表達(dá)繼續(xù)下降，2 周后腫瘤組織內(nèi)仍有少量p ．g a l 基因表達(dá)。腫瘤組織中導(dǎo)入的p ．g a l 基因的表達(dá)水平還隨復(fù)合體劑量的增加而上升。含D N A 1 9 9 的復(fù)合體是皮下瘤周注射的最佳劑量。這一設(shè)計(jì)思路將基因?qū)胂到y(tǒng)中各種功能成分連接后通過(guò)基因工程方法表達(dá)，屬首次嘗試與報(bào)道，因此僅僅是一個(gè)起點(diǎn)。由于給藥后，復(fù)合體顆粒要?dú)v經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的重重障礙，才能到達(dá)靶細(xì)胞核，在整個(gè)過(guò)程中，有眾多干擾因素阻礙著復(fù)合體的導(dǎo)入進(jìn)程，增加復(fù)合體