以erbB-2受體為靶向的活化T細(xì)胞的抗腫瘤基因治療基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:
　　本研究將重組表達(dá)質(zhì)粒pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)先轉(zhuǎn)染T細(xì)胞株Jurkat，然后轉(zhuǎn)染外周血T細(xì)胞，篩選并檢測(cè)蛋白表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染陽性外周血T細(xì)胞的活化程度，特異性結(jié)合、殺傷erbB2陽性腫瘤細(xì)胞的能力。即構(gòu)建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的外周血T細(xì)胞，為erbB2過表達(dá)腫瘤的靶向基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　

2、1.重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人T細(xì)胞株Jurkat、篩選、鑒定、蛋白表達(dá)檢測(cè)
　　應(yīng)用脂質(zhì)體法和電轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)質(zhì)粒PLNCX/anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞株，先用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合基因瞬時(shí)表達(dá)情況，然后用含1000μg/mLG418的RPMI1640培養(yǎng)液篩選轉(zhuǎn)染陽性Jurkat細(xì)胞株，篩選后， PCR鑒定融合基因，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、Western blot檢測(cè)融合基因

3、的穩(wěn)定表達(dá)情況。
　　2.重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人外周血T細(xì)胞、篩選、鑒定、蛋白表達(dá)檢測(cè)
　　從人外周血中分離培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞，采用電轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)質(zhì)粒PLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)轉(zhuǎn)染至外周T，用含600μg/mL G418的RPMI1640培養(yǎng)液篩選轉(zhuǎn)染陽性T細(xì)胞，先用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)融合基因表達(dá)情況，然后用westernblot驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況。
　　3.轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)

4、胞結(jié)合erbB2陽性腫瘤細(xì)胞SK-BR-3能力的檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)組在6孔板中每孔加入1ml2×106轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞和1ml1×105erbB2陽性腫瘤細(xì)胞SK-BR-3，體外共同培養(yǎng)48小時(shí)后，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞結(jié)合SK-BR-3的情況，SK-BR-3細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的變化。以未轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞和SK-BR-3共同培養(yǎng)為陰性對(duì)照組。
　　4.ELISA夾心法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的外周T與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)后上清中IL-2和I

5、FN-γ的含量
　　把轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞與erbB2陽性腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3在體外共同培養(yǎng)3天，ELISA法檢測(cè)共同培養(yǎng)上清液中轉(zhuǎn)染T細(xì)胞激活情況包括IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子水平。以未轉(zhuǎn)染的外周T和erbB2陰性乳腺癌細(xì)胞MCF-7為兩組陰性對(duì)照。
　　5.LDH釋放法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的外周T對(duì)erbB2陽性腫瘤細(xì)胞SK-BR-3的殺傷能力
　　96孔板每孔加100μl，1×104個(gè)/每種細(xì)胞:包括單獨(dú)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染的外

6、周T（效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔）、單獨(dú)培養(yǎng)的SK-BR-3（靶細(xì)胞自然釋放孔）、待裂解的單獨(dú)培養(yǎng)的SK-BR-3（靶細(xì)胞最大釋放孔）、轉(zhuǎn)染的外周T與SK-BR-3共培養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)孔）以及無細(xì)胞的培養(yǎng)液（空白孔）。共培養(yǎng)48h。以未轉(zhuǎn)染的外周T和erbB2陰性乳腺癌細(xì)胞MCF-7為兩組陰性對(duì)照。LDH法檢測(cè)O.D.值。并比較外周血T細(xì)胞膜表面錨定的anti-erbB-2 scFv與可溶性Herceptin（MTT法檢測(cè)）抑制殺傷靶細(xì)胞能力的差異。<

7、br>　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染T細(xì)胞株及融合基因表達(dá)情況
　　重組表達(dá)質(zhì)粒PLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat，在轉(zhuǎn)染36h后能夠檢測(cè)到融合蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后用G418篩選15d，經(jīng)PCR鑒定存在融合基因，經(jīng)RT-PCR、Western blot檢測(cè)能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，融合蛋白表達(dá)量達(dá)42.76％。
　　2.轉(zhuǎn)染外周血T淋巴細(xì)胞及融合

8、基因表達(dá)情況
　　電轉(zhuǎn)染外周T經(jīng)G418篩選后獲得大量穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原代T淋巴細(xì)胞，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)均有蛋白表達(dá)。
　　3.轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞結(jié)合erbB2陽性腫瘤細(xì)胞的能力
　　轉(zhuǎn)染的外周T與erbB2陽性腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3在體外共同培養(yǎng)48h，顯微鏡下觀察SK-BR-3細(xì)胞株變圓、拉絲、碎片增加，數(shù)量減少，且T細(xì)胞圍在SK-BR-3細(xì)胞的周圍，形成花環(huán)狀。
　　4.轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞

9、的激活情況
　　轉(zhuǎn)染的外周T與erbB2陽性腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3在體外共同培養(yǎng)3天，ELISA夾心法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-γ水平與對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05)。
　　5.轉(zhuǎn)染的外周血T細(xì)胞對(duì)erbB2陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷能力
　　LDH釋放法檢測(cè)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的殺傷效率為58％左右。轉(zhuǎn)染的外周T對(duì)SK-BR-3的殺傷率％較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論: