4830.酵母ars缺失突變體的構(gòu)建及組蛋白h3h4定點突變菌株功能的檢測_第1頁
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1、碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文論文題目:論文題目:酵母ARS缺失突變體的構(gòu)建及組蛋白H3H4定點突變菌株功能的檢測英文題目:英文題目:ConstructionofAutonomouslyReplicatingSequenceDeletionStrainsFunctionDetectionofPointMutationsofH3H4HistonesinS.cerevisiae學(xué)位類別學(xué)位類別:理學(xué)碩士研究生姓研究生姓名:薛濤濤學(xué)號學(xué)號:2013

2、023065學(xué)科學(xué)科(領(lǐng)域領(lǐng)域)名稱名稱:生物學(xué)(微生物學(xué))指導(dǎo)教指導(dǎo)教師:趙秀娟職稱職稱:教授協(xié)助指導(dǎo)教師:協(xié)助指導(dǎo)教師:職稱:職稱:2016年6月20日分類號:分類號:Q9393密級:級:公開公開UDC:學(xué)校代碼:學(xué)校代碼:1012710127內(nèi)蒙古科技大學(xué)碩士學(xué)位論文I摘要真核生物DNA復(fù)制起始的準(zhǔn)確調(diào)控是DNA復(fù)制的重要保障,其中,復(fù)制起始位點的選擇與組蛋白的表觀遺傳修飾是調(diào)控DNA復(fù)制起始的重要方式。DNA復(fù)制的起始主要受酵母

3、自主復(fù)制序列ARS與復(fù)制起始蛋白的調(diào)控,組蛋白H3H4上所發(fā)生的乙?;⒓谆刃揎椧矃⑴c了DNA的復(fù)制與損傷修復(fù)等過程。本文工作包括構(gòu)建釀酒酵母III號染色體ARS缺失突變體、構(gòu)建釀酒酵母組蛋白H3H4定點突變體、RealtimePCR法檢測組蛋白H4K5乙?;瘜?fù)制起始相關(guān)蛋白表達的影響及組蛋白定點突變體的功能驗證,對研究釀酒酵母DNA復(fù)制起始調(diào)控的機制具有重要的生物學(xué)意義。具體內(nèi)容如下:1.以釀酒酵母BY4741為實驗材料,依據(jù)酵

4、母同源重組原理構(gòu)建高活性ARS306缺失突變株。以質(zhì)粒pRS416為模板,經(jīng)PCR擴增得到URA3基因,采用PCR介導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化的方法來敲除高活性的ARS306。為了消除外源標(biāo)記基因序列對復(fù)制起始的影響,以質(zhì)粒HcKanP為載體,構(gòu)建了含高活性ARS左右同源臂相連接的序列的重組子質(zhì)粒,為后續(xù)ARS突變株的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。2.采用兩步替換法構(gòu)建酵母組蛋白H3H4定點突變菌株。第一步用NAT基因置換掉II號染色體組蛋白H3H4基因HHT1HH

5、F1,從而構(gòu)建了以諾爾斯菌素抗性基因為標(biāo)記基因的釀酒酵母HHT1HHF1敲除菌株,第二步通過對組蛋白H3H4定點突變質(zhì)粒進行了酶切得到H3定點突變基因hhtSHHFS及H4定點突變基因HHTShhfS,依據(jù)同源重組的原理替換掉了XIV號染色體組蛋白H3H4基因HHT2HHF2,得到組蛋白H3H4定點突變體,為后續(xù)研究組蛋白修飾的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。3.利用RealtimePCR技術(shù)來檢測釀酒酵母組蛋白H4K5位點去乙?;瘜?fù)制起始相關(guān)

6、蛋白基因表達的影響,從而進一步探討組蛋白H4第5位賴氨酸(K)修飾對酵母DNA復(fù)制的重要性。相對定量結(jié)果顯示,組蛋白H4第5位賴氨酸在去乙?;癄顟B(tài)下,基因PSF3的表達與野生型相比無明顯變化,表明組蛋白H4第5位賴氨酸的乙?;揎棇?fù)制起始過程中PSF3基因的表達不具有影響,而基因CDT1的表達上調(diào)了約7.5~8.0倍,基因CDC6上調(diào)了約2.0~2.5倍,CDC7基因上調(diào)了約2.5~3.0倍,表明組蛋白H4第5位賴氨酸的去乙?;{(diào)控了

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