4830.酵母ars缺失突變體的構(gòu)建及組蛋白h3h4定點突變菌株功能的檢測

1、碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文論文題目：論文題目：酵母ARS缺失突變體的構(gòu)建及組蛋白H3H4定點突變菌株功能的檢測英文題目：英文題目：ConstructionofAutonomouslyReplicatingSequenceDeletionStrainsFunctionDetectionofPointMutationsofH3H4HistonesinS.cerevisiae學(xué)位類別學(xué)位類別：理學(xué)碩士研究生姓研究生姓名：薛濤濤學(xué)號學(xué)號：2013

2、023065學(xué)科學(xué)科(領(lǐng)域領(lǐng)域)名稱名稱：生物學(xué)（微生物學(xué)）指導(dǎo)教指導(dǎo)教師：趙秀娟職稱職稱：教授協(xié)助指導(dǎo)教師：協(xié)助指導(dǎo)教師：職稱：職稱：2016年6月20日分類號：分類號：Q9393密級：級：公開公開UDC：學(xué)校代碼：學(xué)校代碼：1012710127內(nèi)蒙古科技大學(xué)碩士學(xué)位論文I摘要真核生物DNA復(fù)制起始的準(zhǔn)確調(diào)控是DNA復(fù)制的重要保障，其中，復(fù)制起始位點的選擇與組蛋白的表觀遺傳修飾是調(diào)控DNA復(fù)制起始的重要方式。DNA復(fù)制的起始主要受酵母

3、自主復(fù)制序列ARS與復(fù)制起始蛋白的調(diào)控，組蛋白H3H4上所發(fā)生的乙?；⒓谆刃揎椧矃⑴c了DNA的復(fù)制與損傷修復(fù)等過程。本文工作包括構(gòu)建釀酒酵母III號染色體ARS缺失突變體、構(gòu)建釀酒酵母組蛋白H3H4定點突變體、RealtimePCR法檢測組蛋白H4K5乙?；瘜?fù)制起始相關(guān)蛋白表達的影響及組蛋白定點突變體的功能驗證，對研究釀酒酵母DNA復(fù)制起始調(diào)控的機制具有重要的生物學(xué)意義。具體內(nèi)容如下：1.以釀酒酵母BY4741為實驗材料，依據(jù)酵

4、母同源重組原理構(gòu)建高活性ARS306缺失突變株。以質(zhì)粒pRS416為模板，經(jīng)PCR擴增得到URA3基因，采用PCR介導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化的方法來敲除高活性的ARS306。為了消除外源標(biāo)記基因序列對復(fù)制起始的影響，以質(zhì)粒HcKanP為載體，構(gòu)建了含高活性ARS左右同源臂相連接的序列的重組子質(zhì)粒，為后續(xù)ARS突變株的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。2.采用兩步替換法構(gòu)建酵母組蛋白H3H4定點突變菌株。第一步用NAT基因置換掉II號染色體組蛋白H3H4基因HHT1HH

5、F1，從而構(gòu)建了以諾爾斯菌素抗性基因為標(biāo)記基因的釀酒酵母HHT1HHF1敲除菌株，第二步通過對組蛋白H3H4定點突變質(zhì)粒進行了酶切得到H3定點突變基因hhtSHHFS及H4定點突變基因HHTShhfS，依據(jù)同源重組的原理替換掉了XIV號染色體組蛋白H3H4基因HHT2HHF2，得到組蛋白H3H4定點突變體，為后續(xù)研究組蛋白修飾的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。3.利用RealtimePCR技術(shù)來檢測釀酒酵母組蛋白H4K5位點去乙?；瘜?fù)制起始相關(guān)

6、蛋白基因表達的影響，從而進一步探討組蛋白H4第5位賴氨酸(K)修飾對酵母DNA復(fù)制的重要性。相對定量結(jié)果顯示，組蛋白H4第5位賴氨酸在去乙?；癄顟B(tài)下，基因PSF3的表達與野生型相比無明顯變化，表明組蛋白H4第5位賴氨酸的乙?；揎棇?fù)制起始過程中PSF3基因的表達不具有影響，而基因CDT1的表達上調(diào)了約7.5~8.0倍，基因CDC6上調(diào)了約2.0~2.5倍，CDC7基因上調(diào)了約2.5~3.0倍，表明組蛋白H4第5位賴氨酸的去乙?；{(diào)控了