酵母組蛋白H3K9L、K27L單突變及雙突變對(duì)Elp3功能和SSA3等表達(dá)的影響.pdf

1、目的:組蛋白乙?；⒓谆缺碛^遺傳修飾對(duì)基因表達(dá)調(diào)控具有重要影響。已有的研究結(jié)果表明，由6個(gè)亞基組成的酵母Elongator復(fù)合物作為一個(gè)具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性的復(fù)合體協(xié)助高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ參與SSA3，GAL1等基因的轉(zhuǎn)錄延伸過程。在體外去除HeLa細(xì)胞抽提物中的Elongator復(fù)合物可降低其轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)模板的速率，也提供了人Elongator復(fù)合物參與轉(zhuǎn)錄延伸的生化證據(jù)。已知人與酵母Elongator復(fù)合物組成高度保守

2、,功能也極為相似,其Elp3亞基C端的保守區(qū)是組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的核心,在N端還存在第二結(jié)構(gòu)域——即潛在的組蛋白去甲基化酶活性結(jié)構(gòu)域。目前已有較多針對(duì)Elp3HAT活性功能的報(bào)道,但對(duì)Elp3第二結(jié)構(gòu)域功能及其與組蛋白甲基化修飾之間的關(guān)系研究較少。
　　 為了解組蛋白甲基化狀態(tài)與人Elp3功能和特定基因表達(dá)的關(guān)系,本文構(gòu)建特定位點(diǎn)組蛋白甲基化突變株,運(yùn)用酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和基因表達(dá)分析體系研究基因組水平甲基化改變對(duì)全長(zhǎng)和第二結(jié)

3、構(gòu)域缺失的酵母和人ELP3補(bǔ)償功能的影響,為深入研究Elongator復(fù)合物的催化亞基Elp3和其第二催化結(jié)構(gòu)域在真核基因表達(dá)調(diào)控中的功能奠定基礎(chǔ),也為探索某些與轉(zhuǎn)錄相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理，疾病預(yù)防、檢測(cè)、治療和預(yù)后提供有價(jià)值的信息。
　　 方法:首先運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得含有與突變有關(guān)的組蛋白特定甲基化位點(diǎn)(H3K9，H3K27)氨基酸突變的著絲粒型載體；然后通過PlasmidShuffle實(shí)驗(yàn)用突變組蛋白取代野生組蛋白得到的組蛋白

4、H3/H4特定甲基化位點(diǎn)突變并伴隨酵母ELP3基因缺失的系列突變菌株；運(yùn)用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法將Elp3系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)入系列組蛋白突變并伴隨ELP3缺失的突變株:最后通過高溫、高鹽、咖啡因等敏感性實(shí)驗(yàn)和SSSA3、GAL1等基因表達(dá)的檢測(cè)，確定基因組水平甲基化位點(diǎn)突變對(duì)人ELP3補(bǔ)償功能和SSA3、GAL1等基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:1、運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得含有與突變有關(guān)的組蛋白特定甲基化位點(diǎn)(H3K9，H3K27)氨基酸突變的著絲粒型

5、載體。
　　 2、利用PlasmidShuffle技術(shù)構(gòu)建了含組蛋白H3/H4的K9、K27單突變?yōu)楹碗p突變?yōu)榱涟彼岬膃lp3Δ菌株。
　　 3、將全長(zhǎng)和第二結(jié)構(gòu)域缺失的酵母和人ELP3轉(zhuǎn)入上述組蛋白突變elp3Δ菌株進(jìn)行的功能互補(bǔ)和基因表達(dá)分析,結(jié)果表明上述組蛋白甲基化位點(diǎn)突變嚴(yán)重影響了hELP3對(duì)elp3Δ菌株生長(zhǎng)缺陷和SSA3和GALl延遲表達(dá)的補(bǔ)償功能，并使yELP3的補(bǔ)償功能明顯降低。
　　 4、在供試

6、的各種條件下，轉(zhuǎn)入yELP3基因的H3K9/H3K27雙突變elp3Δ菌株生長(zhǎng)不如H3K9或H3K27單突變elp3Δ菌株,而H3K27單突變elp3Δ菌株生長(zhǎng)不如H3K9單突變elp3Δ菌株。
　　 結(jié)論:1、組蛋白H3K9，H3K27突變?yōu)榱涟彼岵煌潭冉档土私湍负腿薊lp3對(duì)elp3Δ菌株生長(zhǎng)缺陷和SSA3、GAL1表達(dá)延遲缺陷的補(bǔ)償功能。在組蛋白雙突變條件下，轉(zhuǎn)入完整及第二結(jié)構(gòu)域缺失的酵母和人Elp3各轉(zhuǎn)化株之間的生長(zhǎng)差

7、異不如對(duì)應(yīng)的單突變株之間的差異明顯。但各組蛋白突變均未使elp3Δ菌株產(chǎn)生比組蛋白野生elp3Δ菌株更為嚴(yán)重的缺陷表型，提示Elp3可能與H3K9，H3K27的甲基化狀態(tài)并無直接關(guān)系。
　　 2、組蛋白H3K9/H3K27雙突變elp3Δ菌株產(chǎn)生比組蛋白H3K9或H3K27單突變elp3Δ菌株更為嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷，H3K27突變elp3Δ菌株生長(zhǎng)不如H3K9突變株。表明組蛋白H3K9和K27維持一定的甲基化水平在對(duì)酵母細(xì)胞的正常生