酵母組蛋白H3K79L、H4K20L單突變及雙突變對(duì)Elp3功能和SSA3等表達(dá)的影響.pdf

1、目的:組蛋白修飾在基因表達(dá)調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用,是表觀遺傳中重要的調(diào)控機(jī)制之一。組蛋白乙?；⒓谆刃揎棇?duì)基因表達(dá)調(diào)控具有重要影響?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示,酵母Elongator復(fù)合物是由6個(gè)亞基組成,作為具有組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的復(fù)合體協(xié)助高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ參與SSA3,GAL1等基因的轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程。在體外去除HeLa細(xì)胞抽提物中的Elongator復(fù)合物可降低其轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)模板的速率,也為人Elongator復(fù)合物

2、參與轉(zhuǎn)錄延伸提供了生化證據(jù)。已知酵母和人Elongator復(fù)合物組成高度保守,且功能極為相似,其催化亞基Elp3 C端的保守HAT活性核心,為Elongator行使功能所必需。生物信息學(xué)分析表明Elp3的N末端還有一個(gè)類似S-腺苷甲硫氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)e4S4簇,可結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸,可能與甲基化反應(yīng)有關(guān),因而推測(cè)這個(gè)未知功能的催化結(jié)構(gòu)域可能擁有組蛋白去甲基酶活性。Greenwood等研究表明Elongator無(wú)組蛋白去

3、甲基化酶活性,其Elp3 N端的FeS簇為Elongator保持結(jié)構(gòu)完整性所必需。因此目前Elp3第二結(jié)構(gòu)域的功能尚不清楚。
　　 組蛋白特定位點(diǎn)的()乙?；?、甲基化修飾對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和基因的轉(zhuǎn)錄有重要影響。為研究組蛋白甲基化與Elp3功能和特定基因表達(dá)的關(guān)系,本文構(gòu)建了酵母組蛋白H3K79或/和H4K20突變?yōu)榱涟彼岵?)伴隨Elp3缺失的三個(gè)突變菌株,運(yùn)用酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及基因表達(dá)分析體系以研究在基因組水平甲基化的改變對(duì)全長(zhǎng)

4、和第二結(jié)構(gòu)域缺失的酵母和人ELP3補(bǔ)償功能的影響,以便深入了解Elp3功能及其與組蛋白乙酰化、甲基化的關(guān)系。
　　 方法:運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得組蛋白特定甲基化位點(diǎn)(H3K79,H4K20)氨基酸突變的著絲粒型載體;通過(guò)Plasmid Shuffle實(shí)驗(yàn)用突變組蛋白取代野生組蛋白得到的組蛋白H3/H4特定甲基化位點(diǎn)突變并伴隨酵母ELP3基因缺失的系列突變菌株;運(yùn)用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法將Elp3系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)入系列組蛋白突變并伴隨ELP3缺失的

5、突變株;通過(guò)高溫、高鹽、咖啡因等敏感性實(shí)驗(yàn)和SSA3、GAL1等基因表達(dá)的檢測(cè),確定基因組水平甲基化位點(diǎn)突變對(duì)ELP3補(bǔ)償功能和SSA3、GAL1等基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:1、利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建組蛋白特定甲基化位點(diǎn)(H3K79,H4K20)氨基酸突變的著絲粒型載體。
　　 2、運(yùn)用Plasmid Shuffle技術(shù)獲得組蛋白的H3K79、H4K20單突變和雙突變?yōu)榱涟彼岬膃lp3△菌株。
　　 3、轉(zhuǎn)入全

6、長(zhǎng)和第二結(jié)構(gòu)域缺失的酵母和人ELP3至組蛋白突變elp3△菌株作功能互補(bǔ)和基因表達(dá)分析,結(jié)果表明特定組蛋白甲基化位點(diǎn)突變嚴(yán)重影響了hELP3對(duì)elp3△菌株生長(zhǎng)缺陷和SSA3和GAL1延遲表達(dá)的補(bǔ)償功能,并使yELP3的補(bǔ)償功能明顯降低;第二結(jié)構(gòu)域缺失的酵母和人ELP3幾乎無(wú)補(bǔ)償功能。
　　 4、在供試的各種條件下,轉(zhuǎn)入yELP3基因的H3K79單突變elp3△菌株生長(zhǎng)不如H4K20單突變elp3△菌株,而H4K20單突變elp

7、3△菌株生長(zhǎng)不如H3K79/H4K20雙突變elp3△菌株。
　　 結(jié)論:1、組蛋白H3K79,H4K20突變?yōu)榱涟彼岵煌潭冉档土私湍负腿薊LP3對(duì)elp3△菌株生長(zhǎng)缺陷和SSA3、GAL1表達(dá)延遲缺陷的補(bǔ)償功能。組蛋白雙突變情況下,轉(zhuǎn)入完整及第二結(jié)構(gòu)域缺失的酵母和人ELP3各轉(zhuǎn)化株之間的生長(zhǎng)差異不如對(duì)應(yīng)的單突變株之間的差異明顯。但各組蛋白突變均未使elp3△菌株產(chǎn)生比組蛋白野生elp3△菌株更為嚴(yán)重的缺陷表型,表明Elp3可

8、能與H3K79,H4K20的甲基化狀態(tài)并無(wú)直接關(guān)系。
　　 2、組蛋白H3K79單突變elp3△菌株產(chǎn)生比組蛋白H4K20單突變elp3△菌株更為嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷,H4K20突變elp3△菌株生長(zhǎng)不如H3K79/H4K20雙突變株。表明組蛋白不同位點(diǎn)的甲基化修飾對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不同,組蛋白H3K79和H4K20維持一定的甲基化水平對(duì)酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)尤其重要,在不利條件的快速適應(yīng)方面H3K79的甲基化平衡可能比H4K20更為重要。<