2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩55頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、背景:哺乳動物卵母細胞的體外培養(yǎng)成熟(in-vitro maturation,IVM)聯(lián)合體外受精(in-vitro fertilization,IVF)和體外胚胎培養(yǎng)(in-vitro embryo culture,IVC)技術已被廣泛應用于基礎研究及人類不育的臨床治療。IVM技術是指直接從卵巢中取得未成熟卵母細胞,在體外培養(yǎng)至第二次減數(shù)分裂中期(metaphaseⅡstage of meiosis,MⅡ)。卵母細胞IVM應用于臨床有

2、以下幾個重要原因:(1)可以避免卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS);(2)IVM聯(lián)合卵巢或卵母細胞冷凍技術可以為接受癌癥化療的婦女提供妊娠機會;(3)可以解決目前臨床上誘導排卵方案存在的許多問題,如高昂的醫(yī)療費用以及激素刺激所帶來的副反應。基于上述優(yōu)點,IVM技術較傳統(tǒng)的體外受精(IVF)技術容易被患者接受。許多不育機構嘗試運用IVM技術治療病人,但是IVM的成功率明顯低于

3、IVF。在卵子形成過程中,卵母細胞與其周圍的體細胞存在著交互對話。諸如營養(yǎng)物質(zhì)、激素的變化以及環(huán)境混合物等因素均可對卵子的質(zhì)量和后續(xù)的胚胎生長產(chǎn)生重大的影響。體外培養(yǎng)成熟組的卵母細胞是在模擬體內(nèi)的微環(huán)境中發(fā)育,由于缺乏體內(nèi)完善的自我調(diào)控系統(tǒng),模擬環(huán)境的穩(wěn)定性不及體內(nèi);其次,培養(yǎng)過程中的體外操作步驟不可避免地將卵母細胞暴露于變化的環(huán)境中,如室溫、可見光光線等;它們有可能對卵母細胞發(fā)育造成影響。基因組DNA及其表觀遺傳學修飾等眾多的分子生物

4、學機制共同調(diào)控哺乳動物的生長。在哺乳動物的生殖、發(fā)育或疾病的某些特殊時期,細胞會通過染色質(zhì)DNA甲基化水平改變,組蛋白尾部修飾,非組蛋白的結合,染色質(zhì)重塑,有序地調(diào)整基因表達,其過程不涉及DNA堿基序列改變,稱為表遺傳修飾重新編程。表遺傳標志是可以通過有絲分裂和減數(shù)分裂遺傳的?;蚣せ?失活的精確時間點對正常的植入前胚胎發(fā)育至關重要,任何表達的延遲或缺失都會導致異常。因此,重新編程需獲得激活的正確時間點和基因表達的完好的排列方式,以啟動

5、和繼續(xù)受精之后的胚胎發(fā)育。卵子有效阻止多精受精的能力明顯地受成熟度的影響。卵母細胞具有重組進入其內(nèi)精子染色體的功能,使之轉(zhuǎn)變?yōu)樾墼?pronucleus,PN),并參與全部染色體甲基化和乙?;谋磉z傳重組過程。體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞易出現(xiàn)紡錘體和染色體的異常,表觀遺傳重新編程能力的下降,這些異??赡芘c受精率低有關。染色質(zhì)的基本單位為核小體,核小體由四種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各兩分子構成的八聚體和纏繞其上的DNA所構成。組

6、蛋白翻譯完成后,其氨基尾巴會發(fā)生多種共價修飾,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等,這些修飾方式共同構成了“組蛋白密碼”。核心組蛋白的修飾影響染色質(zhì)的結構和功能。在基因沉默相關的各種組蛋白修飾中,最典型的是組蛋白去乙酰化和甲基化。甲基化是組蛋白各種修飾中最復雜的修飾方式,甲基位點可以是賴氨酸(lysine,K)殘基和精氨酸(argine,Arg)殘基,與轉(zhuǎn)錄激活和抑制都相關。H3K9的甲基化可招募HP1(heterochromat

7、in proteins)或其同源物與之結合,從而使基因所在部位異染色質(zhì)化,這表明,組蛋白的甲基化可能與異染色質(zhì)的形成有關,并且調(diào)控著個別基因的表達。H3K9Me3(histone H3lysine9 tri-methylation)參與異染色質(zhì)的形成和維持,使基因表達沉默。組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferases,HMTs)完成的?;蚧钚詥幼幽技疕3K9Me3特異甲基化轉(zhuǎn)移酶導致異染色

8、質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄抑制。ESET(ERG-associated protein with SET domain)是一種組蛋白H3K9三甲基轉(zhuǎn)移酶,它通過特異性三甲基化組蛋白H3K9,行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控和隨后的局部染色質(zhì)修飾的功能,進而導致基因沉默并參與異染色質(zhì)的維持。作為一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT),ESET可能與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的其他染色質(zhì)重塑酶組成復合物。ESET/SETDB1是催化H3K9Me3的唯一常染色質(zhì)HMT。眾多研究表明,體外操作的各

9、個環(huán)節(jié)及培養(yǎng)環(huán)境均可能影響卵母細胞的生長發(fā)育,影響表觀遺傳重新編程。組蛋白修飾參與染色體類型的轉(zhuǎn)變,調(diào)節(jié)卵母細胞的生長發(fā)育。H3K9Me3和ESET在卵母細胞的表觀遺傳重新編程,卵母細胞形成過程中基因轉(zhuǎn)錄及成熟后的受精中都有重要作用。通過對IVM卵母細胞的研究,可以揭示外部因素對卵母細胞生長發(fā)育的影響、組蛋白修飾、表觀遺傳重新編程的作用并為IVM技術的安全性提供理論支持。但是至今還未見關于IVM卵母細胞H3K9Me3和ESET表達的研究

10、。因此,我們采用機械方法獲取小鼠GV期卵母細胞,在體外培養(yǎng)成熟,測量IVM卵母細胞的直徑,通過RT-PCR方法檢測ESET基因mRNA水平,免疫熒光細胞化學方法檢測IVM卵母細胞ESET和H3K9Me3蛋白表達,并與體內(nèi)成熟組進行比較。研究目的觀察小鼠經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞的體積、ESET基因mRNA水平、ESET和H3K9Me3蛋白表達,比較它們在IVM卵母細胞與體內(nèi)成熟的卵母細胞之間的差異,探討外部因素對卵母細胞生長發(fā)育和組蛋白修

11、飾的作用并為IVM技術的安全性提供理論支持。材料方法:1.實驗動物ICR品系雌性小鼠2.實驗分組2.1 IVM組ICR品系雌性小鼠經(jīng)孕馬血清促性腺激素(pregnant mareserum gonadotropin,PMSG)超促排卵46~48h后,頸椎脫臼法處死,采用針剝法撕破雙側(cè)卵巢取GV期卵母細胞。在MHTF中漂洗一遍,轉(zhuǎn)移至含有激素(rFSH0.075IU/ml,hCG0.5IU/ml)的HTF培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)14~16h

12、后,從培養(yǎng)系統(tǒng)中收集成熟卵母細胞(MⅡ期)。2.2體內(nèi)組ICR品系雌性小鼠經(jīng)PMSG超促排卵46~48h后,注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG),注射HCG后13~15h頸椎法脫臼法處死。用注射器刺破輸卵管膨大部,獲取卵母細胞-放射冠-卵丘細胞復合物(oocyte-conora-cumulus complexes,OCCs),透明質(zhì)酸酶消化顆粒細胞5~10min,獲取MⅡ期裸卵。3.

13、利用MacBiophotonics Image J軟件測量卵母細胞直徑。4.以18S RNA為參照,RT-PCR擴增兩組卵母細胞ESET的mRNA,利用KODAK EDAS290凝膠成像系統(tǒng)軟件比較兩組中ESET的mRNA的相對表達量。5.熒光免疫細胞化學法同時檢測ESET和H3K9Me3的蛋白的分布,并應用激光共聚焦掃描顯微鏡(ZEISS LSM510)成像系統(tǒng)的附帶軟件對ESET和H3K9Me3熒光灰度值進行差異比較。6.統(tǒng)計學分析

14、計算卵母細胞ESETmRNA/18S RNA比值及ESET和H3K9Me3熒光灰度值,應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包,行Independent-sample T Test檢驗分析,P<0.05為有顯著性差異。結果:1.IVM卵母細胞的發(fā)育GV期卵母細胞在體外培養(yǎng)14~16h后,成熟率為78.61%。實驗中選取的IVM卵母細胞,直徑平均為(75.03±2.98)um,體內(nèi)成熟的卵母細胞,直徑平均為(95.77±4.03)um(p<0.01

15、)。2.RT-PCR結果ESET mRNA相對表達量在兩組間無顯著性差異(P>0.05)。3.細胞免疫熒光結果3.1無論在IVM組還是在體內(nèi)組,MⅡ期卵母細胞均有明顯的ESET蛋白表達。表達分布特點均為:卵母細胞胞漿內(nèi)的均勻表達,卵母細胞周邊皮質(zhì)區(qū)的表達增強。卵母細胞ESET蛋白免疫熒光染色強度灰度值比較發(fā)現(xiàn)IVM組顯著低于體內(nèi)組(P=0.007)。3.2 H3K9Me3蛋白在MⅡ期卵母細胞表達模式在兩組間無差異,均與DAPI的位置重合

16、,存在于卵母細胞和極體的染色體上。極體染色體的熒光強度顯著高于卵母細胞染色體的熒光強度(P>0.05)。結論1.IVM過程影響卵母細胞的生長發(fā)育,IVM卵母細胞的直徑小于體內(nèi)成熟組的。2.ESET蛋白在MⅡ期卵母細胞表達,表達分布特點均為:卵母細胞胞漿內(nèi)的均勻表達,卵母細胞周邊皮質(zhì)區(qū)的表達增強。IVM過程雖未影響ESET基因的轉(zhuǎn)錄,卻能影響ESET蛋白質(zhì)的表達量。3.甲基化的H3K9—H3K9Me3只表達于MⅡ期卵母細胞的染色質(zhì)/染色體

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論