冷應(yīng)激對豬卵母細胞發(fā)育與CIRP表達的影響.pdf

1、結(jié)合采用豬卵巢卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）、體外受精(invitro fertilization，IVF)和體外培養(yǎng)（in vitro culture，IVC）等技術(shù)，是體外生產(chǎn)（in vitro production，IVP）豬胚胎的主要方式。在實踐過程中，卵巢運輸、撿卵、卵母細胞處理和體外受精等，均需要一定的時間，難免會有溫度的變化，不可避免地會產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)。豬卵母細胞對低溫的反應(yīng)較為敏感，低

2、溫刺激可對豬卵母細胞的成熟質(zhì)量，甚至受精后的發(fā)育能力產(chǎn)生不良影響。目前，大多關(guān)于冷應(yīng)激影響卵母細胞和胚胎發(fā)育的報道，都是在動物個體水平進行的，例如對母豬進行冷應(yīng)激處理;而在細胞水平進行冷應(yīng)激處理，如直接處理豬卵母細胞，研究冷應(yīng)激對其體外成熟等的影響，則少有報道;有關(guān)冷應(yīng)激過程中亞細胞結(jié)構(gòu)的變化及冷誘導RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA-binding protein，CIRP)表達的研究在豬上尚未見報道。在冷應(yīng)激條件下

3、，細胞內(nèi)大多數(shù)基因表達和蛋白質(zhì)合成降低，細胞生長受到抑制，但冷休克蛋白(cold shock proteins，CSP)在冷應(yīng)激條件下可大量表達。這類蛋白主要參與細胞基本功能的調(diào)節(jié)，對細胞產(chǎn)生一定的應(yīng)激保護作用。CIRP是迄今為止在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的少數(shù)冷休克蛋白之一。1997年，Nishiyama等首次從小鼠睪丸細胞中分離到CIRP的cDNA，并發(fā)現(xiàn)CIRP在細胞內(nèi)具有冷應(yīng)激保護功能。研究表明，CIRP在多種生物的細胞中呈組成型表達，

4、具有基因調(diào)控作用，并伴隨著冷應(yīng)激刺激而過量表達。迄今已在非洲瓜蟾、牛蛙、大鼠、小鼠和人類的某些細胞類型，實驗性證實CIRP在冷應(yīng)激條件下的細胞保護作用，對理解人和動物冷應(yīng)激調(diào)節(jié)機制具有重要的意義。推測豬卵母細胞在低溫條件下，也會產(chǎn)生CIRP表達的變化，但其具體作用仍需要實驗證明。本試驗選用先前報道較多的32℃和室溫25℃作為冷應(yīng)激處理溫度，研究冷應(yīng)激對體外培養(yǎng)豬卵母細胞成熟率、受精率和發(fā)育能力的影響;研究冷應(yīng)激處理對卵母細胞微管、微絲等

5、亞細胞結(jié)構(gòu)變化的影響;并通過熒光定量PCR檢測CIRP mRNA的表達規(guī)律，初步分析其在冷應(yīng)激條件下的細胞保護作用機制。試驗內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　1.冷應(yīng)激對豬卵母細胞體外成熟與發(fā)育的影響
　　抽吸法采集卵巢卵母細胞后，以38.5℃培養(yǎng)條件作為對照，試驗組則分別在32℃和25℃環(huán)境溫度下放置30 min，1h和2h。雙醋酸熒光素(FDA)染色檢查各組卵母細胞存活率，體外成熟培養(yǎng)44h后根據(jù)第一極體(pbI)排出情況統(tǒng)計成熟率

6、，成熟卵母細胞進行體外受精，比較各組體外受精卵裂率和囊胚發(fā)育率。結(jié)果表明，冷應(yīng)激刺激后各組卵母細胞存活率未表現(xiàn)出顯著差異;冷應(yīng)激處理對卵母細胞成熟率和體外受精卵裂率的影響也不顯著;32℃2h(9.21％)和25℃2h(9.71％)處理組的囊胚發(fā)育率明顯下降(P＜0.05)，其他各組的囊胚發(fā)育率差異不顯著(P＞0.05)。
　　2.不同保存液對卵母細胞冷應(yīng)激處理后發(fā)育能力的影響
　　室溫(25℃)條件下，將豬GV期卵母細胞分別

7、在TCM199培養(yǎng)液（不添加半胱氨酸、豬卵泡液和促性腺激素）和pFF（豬卵泡液）中放置0.5、2、6、12和24h，轉(zhuǎn)至38.5℃培養(yǎng)44h，觀察卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COC)形態(tài)變化，統(tǒng)計卵母細胞成熟率、孤雌激活卵裂率和囊胚發(fā)育率，觀察不同保存液對豬卵母細胞冷應(yīng)激處理后體外發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示，TCM199較pFF更有利于冷應(yīng)激條件下豬卵母細胞的保存;冷應(yīng)激處理后，pFF組卵丘細胞出現(xiàn)大量脫落，胞質(zhì)顏色變淺;TCM199處理6、1

8、2、24 h后的成熟率(57.3％、58.0％和55.0％)較對照組(77.4％)有顯著下降(P＜0.05)，而pFF處理6、12、24 h后的成熟率（51.1％、52.9％和48.8％）有極顯著下降(P＜0.01)。卵裂率除pFF24 h處理組外無顯著變化，但囊胚發(fā)育率變化較大，冷應(yīng)激處理6、12和24 h組中，TCM199組囊胚發(fā)育率（11.4％、10.3％和12.1％）均較對照組(22.2％)有明顯下降(P＜0.05)，而pFF組

9、的囊胚發(fā)育率分別為4.4％、0％和0％(P＜0.01)。
　　3.豬卵母細胞冷應(yīng)激條件下細胞骨架的變化
　　對豬GV期卵母細胞進行不同溫度（32℃和25℃）和不同時間(0、0.5、1和2h)的冷應(yīng)激處理，體外成熟培養(yǎng)44 h，收集成熟卵母細胞，應(yīng)用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微成像技術(shù)，觀察溫和低溫刺激對卵母細胞染色體、紡錘體及微絲形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響。結(jié)果表明，卵母細胞亞細胞結(jié)構(gòu)變化與冷應(yīng)激時間有關(guān)。32℃2h和25℃2h組染

10、色體、紡錘體正常比例（51.43％和53.57％）顯著低于對照組(77.17％; P＜0.05)，其余各組差異不顯著(P＞0.05)。25℃2h組微絲正常比例(76.78％)較對照組(90.22％)有顯著下降(P＜0.05)，其余各組差異不顯著。
　　4.冷應(yīng)激對豬卵母細胞CIRP表達的影響
　　豬GV期卵母細胞于32℃分別放置0、0.5、1、2、4、6、8、10和12h，用熒光定量PCR檢測CIRP mRNA表達的變化，并

11、比較不同冷應(yīng)激溫度(32℃2h與25℃2h）間的表達差異。結(jié)果顯示，冷應(yīng)激可使豬卵母細胞CIRP mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，且在一定范圍內(nèi)隨冷應(yīng)激時間的延長和溫度的降低而增加，32℃處理4h時其表達量最大，超過4h后隨冷應(yīng)激時間的延長而逐漸降低;冷應(yīng)激處理2h時，25℃時CIRP mRNA表達較32℃略有降低，但無顯著差異(P＞0.05)。
　　5.CIRP在豬卵母細胞冷應(yīng)激反應(yīng)中的作用
　　豬GV期卵母細胞

12、在32℃冷應(yīng)激條件下處理0、2和6h，檢測各組卵母細胞CIRP、Bcl-2和SOD-1 mRNA表達的變化，分析冷應(yīng)激條件下CIRP mRNA表達與Bcl-2和SOD-1 mRNA變化的關(guān)系。結(jié)果表明，CIRP mRNA表達與Bcl-2和SOD-1 mRNA表達間存在有相關(guān)性，Bcl-2和SOD-1 mRNA表達量隨CIRPmRNA的升高而升高;CIRP mRNA表達降低時，Bcl-2和SOD-1 mRNA的表達也隨之下降。表明冷應(yīng)激條