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文檔簡(jiǎn)介
1、單精子胞漿內(nèi)注射(jntracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)已在許多動(dòng)物上獲得成功,在豬上也已獲得ICSI后代。隨著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及胚胎生物技術(shù)研究的深入發(fā)展,豬ICSI研究越來(lái)越受到人們的重視。當(dāng)前,豬ICSI胚胎生產(chǎn)的效率仍然較低,許多因素制約著豬ICSI成功率,相關(guān)機(jī)理了解較少。本研究借助于顯微操作技術(shù),將豬凍精注入體外成熟(IVM)卵母細(xì)胞內(nèi),通過(guò)對(duì)注射卵進(jìn)行體外培養(yǎng)與觀察,了解豬ICSI胚胎發(fā)
2、育情況,比較不同激活、不同成熟培養(yǎng)方法及在胚胎培養(yǎng)液中添加L-cys、采用共培養(yǎng)技術(shù)等對(duì)ICSI胚胎體外發(fā)育的影響,并比較凍精I(xiàn)CSI胚胎和體外受精(in vitro fertilization,IVF)胚胎的體外發(fā)育能力;應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)DNA甲基化相關(guān)基因(DNMT1和DNMT3A)及抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)規(guī)律,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:
1.豬ICSI胚胎注射后,分別使用電激活和電激活與化學(xué)激活聯(lián)
3、合激活的方法對(duì)ICSI胚進(jìn)行激活,結(jié)果表明,豬ICSI胚電激活后,在NCSU-23中培養(yǎng)4 h,然后轉(zhuǎn)入到添加2 mM的6-DMAP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h,再移入NCSU-23中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng),胚胎卵裂率可達(dá)75.6%,明顯高于單純電激活組的卵裂率(68.3%);但2種激活方法對(duì)其囊胚發(fā)育率的影響差異不顯著(P>0.05)。
2.用3種不同的成熟培養(yǎng)液對(duì)豬ICSI激活后胚胎進(jìn)行培養(yǎng),用不舍BSA的NCSU-23進(jìn)行IVM,所獲
4、得卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI操作后體外培養(yǎng)48 h后,卵裂率達(dá)78.3%,明顯高于用TCM199+10%NCS組和0.1%PVA組(分別為67.6%和64.8%),但3組間桑椹胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明卵母細(xì)胞的成熟方法并不影響ICSI胚胎的發(fā)育。
3.先在含1.71 mM L-cys的NCSU-23培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h后,再轉(zhuǎn)入不含L-cys的培養(yǎng)液中培養(yǎng),卵裂率和囊胚率與對(duì)照組相比,差異均不顯著,表明
5、添加L-cys并未改善ICSI胚胎的發(fā)育狀況。
4.經(jīng)激活處理的豬ICSI胚胎分別與顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),或直接放入NCSU-23培養(yǎng)液中培養(yǎng),結(jié)果表明,采用顆粒細(xì)胞或卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)豬ICSI胚胎,卵裂率較對(duì)照組有大大提高,其中與卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)的ICSI胚胎卵裂率高達(dá)93.3%,但各組囊胚發(fā)育率沒(méi)有明顯變化(P>0.05)。
5.用本實(shí)驗(yàn)室制備的豬冷凍精子進(jìn)行ICSI和IVF研究,所獲胚胎分別進(jìn)行體外
6、培養(yǎng),比較不同來(lái)源的豬IVP胚胎體外發(fā)育能力。結(jié)果表明,用凍精生產(chǎn)的ICSI胚卵裂率和囊胚發(fā)育率分別為68.3%和11.4%,均低于用凍精進(jìn)行IVF所獲的76.9%卵裂率和19.2%囊胚率(P<0.05)。
6.本實(shí)驗(yàn)以豬GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和豬IVF和ICSI2-細(xì)胞,4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、16-細(xì)胞和桑椹胚期胚胎為研究對(duì)象,采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)與DNA甲基化相關(guān)基因(DNMT1,DNMT3A)的表達(dá)變化
7、規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在卵母胞成熟過(guò)程中,DINMT1 mRNA持續(xù)高水平表達(dá);在胚胎發(fā)育早期,IVF胚胎和ICSI胚胎的DNMT1mRNA的表達(dá)量均急劇降低,可能與胚胎早期去甲基化有關(guān);與IVF胚相比,ICSI胚胎DNMT1具有相同的表達(dá)趨勢(shì),只有在4-cell時(shí)高于IVF胚。DNMT3AmRNA在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中就開(kāi)始急劇下降,經(jīng)2-8cell階段的低水平表達(dá)后又開(kāi)始上升;與IVF胚相比,ICSI胚8-cell后DNMT3AmR
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