豬卵母細(xì)胞單精子胞漿內(nèi)注射及體外發(fā)育研究.pdf

1、單精子胞漿內(nèi)注射（jntracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術(shù)已在許多動物上獲得成功，在豬上也已獲得ICSI后代。隨著轉(zhuǎn)基因動物及胚胎生物技術(shù)研究的深入發(fā)展，豬ICSI研究越來越受到人們的重視。當(dāng)前，豬ICSI胚胎生產(chǎn)的效率仍然較低，許多因素制約著豬ICSI成功率，相關(guān)機理了解較少。本研究借助于顯微操作技術(shù)，將豬凍精注入體外成熟（IVM）卵母細(xì)胞內(nèi)，通過對注射卵進行體外培養(yǎng)與觀察，了解豬ICSI胚胎發(fā)

2、育情況，比較不同激活、不同成熟培養(yǎng)方法及在胚胎培養(yǎng)液中添加L-cys、采用共培養(yǎng)技術(shù)等對ICSI胚胎體外發(fā)育的影響，并比較凍精ICSI胚胎和體外受精（in vitro fertilization，IVF）胚胎的體外發(fā)育能力；應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測DNA甲基化相關(guān)基因（DNMT1和DNMT3A）及抗凋亡基因Bcl-2的表達規(guī)律，實驗內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.豬ICSI胚胎注射后，分別使用電激活和電激活與化學(xué)激活聯(lián)

3、合激活的方法對ICSI胚進行激活，結(jié)果表明，豬ICSI胚電激活后，在NCSU-23中培養(yǎng)4 h，然后轉(zhuǎn)入到添加2 mM的6-DMAP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h，再移入NCSU-23中進行繼續(xù)培養(yǎng)，胚胎卵裂率可達75.6％，明顯高于單純電激活組的卵裂率（68.3％）；但2種激活方法對其囊胚發(fā)育率的影響差異不顯著（P>0.05）。
　　 2.用3種不同的成熟培養(yǎng)液對豬ICSI激活后胚胎進行培養(yǎng)，用不舍BSA的NCSU-23進行IVM，所獲

4、得卵母細(xì)胞進行ICSI操作后體外培養(yǎng)48 h后，卵裂率達78.3％，明顯高于用TCM199+10％NCS組和0.1％PVA組（分別為67.6％和64.8％），但3組間桑椹胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率差異不顯著（P>0.05），說明卵母細(xì)胞的成熟方法并不影響ICSI胚胎的發(fā)育。
　　 3.先在含1.71 mM L-cys的NCSU-23培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h后，再轉(zhuǎn)入不含L-cys的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，卵裂率和囊胚率與對照組相比，差異均不顯著，表明

5、添加L-cys并未改善ICSI胚胎的發(fā)育狀況。
　　 4.經(jīng)激活處理的豬ICSI胚胎分別與顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞進行共培養(yǎng)，或直接放入NCSU-23培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結(jié)果表明，采用顆粒細(xì)胞或卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)豬ICSI胚胎，卵裂率較對照組有大大提高，其中與卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)的ICSI胚胎卵裂率高達93.3％，但各組囊胚發(fā)育率沒有明顯變化（P>0.05）。
　　 5.用本實驗室制備的豬冷凍精子進行ICSI和IVF研究，所獲胚胎分別進行體外

6、培養(yǎng)，比較不同來源的豬IVP胚胎體外發(fā)育能力。結(jié)果表明，用凍精生產(chǎn)的ICSI胚卵裂率和囊胚發(fā)育率分別為68.3％和11.4％，均低于用凍精進行IVF所獲的76.9％卵裂率和19.2％囊胚率（P<0.05）。
　　 6.本實驗以豬GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和豬IVF和ICSI2-細(xì)胞，4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、16-細(xì)胞和桑椹胚期胚胎為研究對象，采用Real-time PCR技術(shù)對與DNA甲基化相關(guān)基因（DNMT1，DNMT3A）的表達變化

7、規(guī)律進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在卵母胞成熟過程中，DINMT1 mRNA持續(xù)高水平表達；在胚胎發(fā)育早期，IVF胚胎和ICSI胚胎的DNMT1mRNA的表達量均急劇降低，可能與胚胎早期去甲基化有關(guān)；與IVF胚相比，ICSI胚胎DNMT1具有相同的表達趨勢，只有在4-cell時高于IVF胚。DNMT3AmRNA在卵母細(xì)胞成熟過程中就開始急劇下降，經(jīng)2-8cell階段的低水平表達后又開始上升；與IVF胚相比，ICSI胚8-cell后DNMT3AmR