牛卵母細(xì)胞冷凍前后CD9表達(dá)量對(duì)精卵結(jié)合的影響.pdf

1、CD9是一種膜蛋白，參與細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化等過(guò)程。哺乳動(dòng)物受精過(guò)程中，精卵結(jié)合和融合是重要環(huán)節(jié)，CD9在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。隨著體外受精-胚胎移植和冷凍技術(shù)的發(fā)展，冷凍技術(shù)在動(dòng)物種質(zhì)資源的保存上得以推廣應(yīng)用。雖然卵母細(xì)胞的冷凍方法在不斷發(fā)展，但是由于冷凍后受到一定的損傷，對(duì)其后期發(fā)育產(chǎn)生一定的影響?？墒牵鋬雎涯讣?xì)胞在體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的研究中顯得尤為凸顯。卵母細(xì)胞的冷凍保存要比胚胎冷凍保存應(yīng)用前景更為廣泛，可以利用冷凍技術(shù)建立

2、卵子庫(kù)，這樣不僅可以解決目前卵母細(xì)胞短缺問(wèn)題，還可以使其他生物技術(shù)不受時(shí)間和空間的限制。本研究探討了不同發(fā)育期卵母細(xì)胞冷凍前后CD9表達(dá)量變化對(duì)精卵結(jié)合融合的影響。研究分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)，獲得如下結(jié)果：
　　1.冷凍對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。本研究采用玻璃化冷凍法對(duì)GV期和MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，結(jié)果表明，冷凍后GV期和MII期卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率分別為51%和66%，與對(duì)照組92%和90%相比差異極顯著（P<0.01）。冷凍后

3、GV期成熟率為43%，與對(duì)照組90%相比差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明冷凍保存對(duì)卵母細(xì)胞有一定的損傷，影響其后續(xù)發(fā)育能力。
　　2.冷凍對(duì)卵母細(xì)胞CD9表達(dá)影響。采用免疫熒光法，對(duì)CD9在GV期和MII期牛卵母細(xì)胞冷凍前后表達(dá)進(jìn)行定位分析，結(jié)果顯示，CD9在GV期和MII期牛卵母細(xì)胞冷凍前后均有表達(dá)。再用免疫印跡法，檢測(cè)CD9在GV期和MII期牛卵母細(xì)胞冷凍前后的表達(dá)量，結(jié)果顯示，均檢測(cè)到24 kD的CD9蛋白。進(jìn)一步灰度分析的

4、結(jié)果顯示，在鮮MII期卵母細(xì)胞CD9表達(dá)量最高，其次為冷凍MII期卵母細(xì)胞，GV期冷凍卵母細(xì)胞表達(dá)量最低。說(shuō)明冷凍保存影響CD9的表達(dá)，而且CD9表達(dá)量隨卵母細(xì)胞發(fā)育成熟而增加。
　　3.CD9抗體及玻璃化冷凍保存對(duì)精卵結(jié)合和融合的影響。用CD9單克隆抗體處理成熟卵母細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析精子結(jié)合卵子數(shù)和精子穿卵率發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組（每卵粘附數(shù)2.2±0.4，穿卵率26%）明顯低于對(duì)照組（每卵粘附數(shù)6.0±0.3，穿卵率88%），差異極顯著（P

5、<0.01），并且呈劑量依賴性，說(shuō)明卵母細(xì)胞膜蛋白CD9參與精卵結(jié)合和融合。GV期冷凍-解凍卵母細(xì)胞成熟后IVF結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（每卵粘附數(shù)3.0±0.3，穿卵率40%）明顯低于對(duì)照組（每卵粘附數(shù)6.0±0.3，穿卵率88%），差異極顯著（P<0.01）。MII期冷凍-解凍卵母細(xì)胞IVF結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（每卵粘附數(shù)3.2±0.4，穿卵率52%）明顯低于對(duì)照組（粘附數(shù)6.0±0.3，穿卵率88%），差異極顯著（P<0.01）。試驗(yàn)結(jié)果表明