玻璃化冷凍對牛卵母細(xì)胞Ca2+及其調(diào)控基因的影響.pdf

1、哺乳動物卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存對胚胎生物技術(shù)的研究，優(yōu)良種畜和瀕危動物種質(zhì)資源的保存具有重要意義。但其解凍后卵母細(xì)胞的受精率及發(fā)育能力顯著低于新鮮卵母細(xì)胞，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的應(yīng)用。其原因在于，玻璃化冷凍會引起卵母細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+([Ca2+]i)濃度異常升高，但目前升高的機(jī)制仍不清楚，因此，本研究從胞內(nèi)鈣庫（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體）角度和分子水平探究了玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞Ca2+濃度升高的來源，同時應(yīng)用Ca2+調(diào)控物質(zhì)BAPTA-AM(或BA

2、PTA)和釕紅(RR)，研究了其對冷凍牛卵母細(xì)胞受精和發(fā)育能力的影響。研究結(jié)果如下:
　　1、體外成熟的牛MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)不同處理分為新鮮、乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)、冷凍液處理和冷凍五組，用染色的方法分析了其[Ca2+]i、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+(ER Ca2+)、線粒體Ca2+(mCa2+)的水平，以及新鮮、冷凍液處理和冷凍組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和IP3I型受體(IP3R1)的形態(tài)分布，結(jié)果表明玻璃化冷凍會使牛卵母細(xì)胞[Ca2+]i、m

3、Ca2+水平升高，ER Ca2+濃度降低（主要由冷凍液中的DMSO引起），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及IP3R1分布異常(P＜0.05)。
　　2、牛MⅡ期卵母細(xì)胞用含0.5、1、2μMRR的體外成熟液處理0.5h，新鮮組和玻璃化冷凍組作對照，分析RR處理對冷凍牛卵母細(xì)胞Ca2+濃度、ATP含量、線粒體膜電位（ΔΨm）水平、凋亡及發(fā)育潛力的影響。結(jié)果表明RR處理能顯著降低冷凍牛卵母細(xì)胞mCa2+濃度(P＜0.05)，使較多的Ca2+留在胞質(zhì)中，對ER

4、 Ca2+濃度無顯著影響;1μMRR處理組卵母細(xì)胞的ATP含量、ΔΨm水平、未凋亡比例以及孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率都顯著高于冷凍組(P＜0.05)，與新鮮組差異不顯著。
　　3、成熟20～22h的牛卵母細(xì)胞用含5、10、20μM BAPTA的成熟液處理2h，新鮮組和冷凍組作對照，分析其Ca2+濃度、皮質(zhì)顆粒(CGs)分布、受精和發(fā)育能力。結(jié)果BAPTA處理能顯著降低冷凍牛卵母細(xì)胞[Ca2+]i水平(P＜0.05)，對ER Ca

5、2+、mCa2+濃度無顯著影響;10μM BAPTA處理能顯著提高冷凍牛卵母細(xì)胞CGs環(huán)形分布和體外受精(IVF)時正常受精的比例，提高卵裂率(P＜0.05)。10μM BAPTA和1μMRR聯(lián)合處理能顯著提高冷凍牛卵母細(xì)胞IVF后的卵裂率、囊胚率和囊胚質(zhì)量(P＜0.05)。
　　4、收集新鮮組和冷凍組牛MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果得到102個差異基因(12個上調(diào)，90個下調(diào))，兩個Ca2+調(diào)節(jié)基因(CALM、SSRG)的m

6、RNA表達(dá)在冷凍組中下調(diào)(P＜0.05);GO功能分析顯示，差異基因主要在細(xì)胞組分中胞內(nèi)膜結(jié)合的細(xì)胞器上富集(P＜0.05);qRT-PCR驗證10個基因mRNA的表達(dá)模式，Western blotting分析CDK2和UCHL3蛋白的表達(dá)水平，均與Smart-seq2分析中一致。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍會降低牛卵母細(xì)胞Ca2+調(diào)控基因(CALM，SSRG)的表達(dá)，引起ER Ca2+釋放（主要由冷凍液中的DMSO引起）