牛GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)優(yōu)化及其作用機(jī)制研究.pdf

1、牛GV期卵母細(xì)胞相對(duì)于成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存要困難很多，但在遠(yuǎn)距離運(yùn)輸卵母細(xì)胞時(shí)，必須進(jìn)行冷凍保存。因此，開(kāi)發(fā)GV期卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)對(duì)于充分利用未成熟卵母細(xì)胞、特別是遠(yuǎn)距離屠宰場(chǎng)卵巢卵母細(xì)胞保存具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。海藻糖(trehalose)是一種類似于蔗糖的非還原性雙糖，能形成玻璃狀保護(hù)層保護(hù)處于極端條件下的生命體，因此探索海藻糖作為非滲透性冷凍保護(hù)劑替代常規(guī)玻璃化冷凍保護(hù)劑(CPA)中蔗糖、用于冷凍保存GV期卵母細(xì)胞的可能性，并

2、找到最適替代濃度是本研究的目的之一。有研究證明，常規(guī)溶解冷凍保護(hù)劑的緩沖介質(zhì)DPBS（杜氏磷酸鹽緩沖液）中的主要成分NaCl，對(duì)胚胎的超低溫冷凍具有一定的危害，但其對(duì)卵母細(xì)胞尤其是GV期卵母細(xì)胞的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究的目的之二，是以氯化膽堿代替NaCl，以及聯(lián)合海藻糖和氯化膽堿用于GV期卵母細(xì)胞的冷凍保存，探索其保護(hù)效果。此外，本研究的目的之三，是研究冷凍損傷的機(jī)制，凋亡基因和周期基因相對(duì)表達(dá)量的差異性。
　　 研究?jī)?nèi)

3、容和結(jié)果如下:
　　 1.不同濃度海藻糖對(duì)牛GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的效果
　　 (1)在對(duì)不同濃度海藻糖作為非滲透性保護(hù)劑對(duì)卵母細(xì)胞存活能力評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)冷凍組中0.5M海藻糖組活力強(qiáng)的比率不如0.5M蔗糖組(39.8％vs52.5％，p＜0.05)，但是0.5M海藻糖組的總的存活的卵母細(xì)胞比率比0.5M蔗糖組高(70.1％ vs63.6％，p＜0.05)，其他冷凍組之間無(wú)顯著差異。
　　 (2)在CPA中

4、添加不同濃度海藻糖后透明帶硬度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，0.5M蔗糖組中透明帶溶解時(shí)間（93±2.5min）顯著少于其他冷凍組，0.5M海藻糖組(95.5±2.6min)、0.3M海藻糖組（93.3±3.8min）除外(p＜0.05)。
　　 (3)卵母細(xì)胞發(fā)育能力與對(duì)照組相比，冷凍顯著降低了胚胎的卵裂率和囊胚率(p＜0.05)，1M海藻糖組、0.8M海藻糖組、0.1M海藻糖組冷凍保存的卵母細(xì)胞不能發(fā)育到囊胚期，0.5M蔗糖組與0.5M海藻糖

5、組、0.3M海藻糖組胚胎的卵裂率和囊胚率差異不顯著(p＞0.05)，且0.5M蔗糖組（13.9±2.3％）和0.5M海藻糖組（12.2±0.9％）、0.3M海藻糖組(10.4±2.8％)的胚胎卵裂率顯著高于其它組（0.8M海藻糖組（7.7±4.3％）除外）(p＜0.05);0.5M蔗糖組（2.5±2.2％）和T3（1.5±1.3％）、0.3M海藻糖組（1.3±2.2％）的囊胚率要高于其它組，但差異不顯著。
　　 (4)檢測(cè)體外培

6、養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞的紡錘體形態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑中濃度相同(0.5mol/L)兩種糖具有類似保護(hù)效果，冷凍液中添加不同濃度的海藻糖會(huì)起到不同程度的保護(hù)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:海藻糖可以作為蔗糖的替代物用于GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍，0.3mol/L-0.8mol/L均能達(dá)到一定的保護(hù)作用，但0.5mol/L為最適宜替代濃度。
　　 2.牛GV期卵母細(xì)胞冷凍損傷的分子機(jī)制
　　 (1)通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒免疫

7、熒光染色法檢測(cè)卵母細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:0.5M蔗糖組（4.1±0.9％）、0.5M海藻糖組（5.5±2.6％）卵母細(xì)胞未凋亡的比率顯著低于(p＜0.05)新鮮卵組（13.0±0.9％）;
　　 (2)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BAX inhibitor和BA，以及細(xì)胞周期相關(guān)基因CDC2和CyclinB1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)凍融的卵母細(xì)胞，其mRNA表達(dá)水平明顯受到影響，凋亡基因BAX和周期相關(guān)基因CDC2表達(dá)水平上

8、調(diào)，另兩個(gè)表達(dá)水平總體下調(diào)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:冷凍引起GV期卵母細(xì)胞凋亡加劇，冷凍損傷主要是通過(guò)引起凋亡的途徑進(jìn)行的。
　　 3.改良磷酸鹽緩沖液(mPBS)配制玻璃化冷凍液卵母細(xì)胞冷凍效果評(píng)價(jià)
　　 （1) CPA中氯化鈉以氯化膽堿替代后，卵母細(xì)胞成活率0.5M蔗糖組(24.2％)顯著低于對(duì)照組(90.4％)、mPBS+0.5M蔗糖組(42.2％)和mPBS+0.5M海藻糖組(47.0％)(p＜0.05)。mP

9、BS+0.5M蔗糖組和mPBS+0.5M海藻糖組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，但后者高于前者(p＞0.05)。
　　 （2) CPA中氯化鈉以氯化膽堿替代后，透明帶溶解時(shí)間冷凍組0.5M蔗糖組(103±4.16 min)顯著長(zhǎng)于mPBS+0.5M海藻糖組(86.67±5.69min)和mPBS+0.5M蔗糖組(89.00±9.54min)(p＜0.05)。
　　 （3) CPA中氯化鈉以氯化膽堿替代后，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后體外受精

10、，受精胚胎的卵裂率，冷凍組顯著低于對(duì)照組(45.4±0.9％，p＜0.05)，mPBS+0.5M蔗糖組(28.4±0.5％)和mPBS+0.5M海藻糖組(26.8±2.1％)顯著高于0.5M蔗糖組(14.2±2.6％)(p＜0.05);囊胚率0.5M蔗糖組（2.3±2.0％）、mPBS+0.5M蔗糖組(3.2±0.1％)低于mPBS+0.5M海藻糖組（3.9±0.9％），三組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著(p＞0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論