組蛋白乙酰化、甲基化改變對酵母細胞生長和GALI、SSA3基因表達的影響.pdf

1、目的：Elongator復(fù)合物作為高度磷酸化的RNAP II全酶的一部分于1999年從酵母染色質(zhì)的延伸復(fù)合物中被首次分離出來，較多的證據(jù)表明該復(fù)合物在染色質(zhì)模板的轉(zhuǎn)錄延伸中具有功能。Elp3是高度保守的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物Elongator的催化亞基，參與tRNA的修飾、胞外分泌及α-tublin的乙?；癛NAPII的轉(zhuǎn)錄延伸等重要生物過程。同時通過對組蛋白乙酰化修飾，影響基因轉(zhuǎn)錄進而影響細胞生長。 研究表明，組蛋白特定位點

2、(如：H3K4，H3K36，H3K4/K36，H3K14，H4K8，H3K14/H4K8)的乙酰化、甲基化修飾對細胞的生長和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有著重要影響。為研究不同修飾位點功能的差異，我們構(gòu)建了不同組蛋白乙?；?、甲基化位點突變菌株，并對其進行敏感性實驗及誘導(dǎo)基因表達分析，以便深入了解組蛋白乙酰化甲基化的重要功能。 已知野生情況下，Elp3參與SSA3等基因的轉(zhuǎn)錄延伸。本論文以組蛋白乙?；?、甲基化位點(H3K4，H3K36，H3K4

3、/K36，H3K14，H4.K8，H3K14/H4K8)突變的elp3△菌株為實驗材料，通過染色質(zhì)免疫沉淀實驗確定特定組蛋白乙?；图谆稽c突變條件下，全長及HAT區(qū)缺失、第二結(jié)構(gòu)域缺失的Elp3是否參與GAL1和SSA3等的轉(zhuǎn)錄延伸。這些研究對于建立酵母Elongator通過表觀遺傳修飾參與基因表達調(diào)控的模型，進一步研究人Elongator功能、探索與其功能異常相關(guān)的疾病的發(fā)生機理具有重要意義。 方法：通過敏感性實驗和基因表

4、達分析研究組蛋白H3/H4上不同的乙?；⒓谆稽c突變對細胞生長和GAL1基因轉(zhuǎn)錄的影響。運用Elp3抗體對轉(zhuǎn)入Elp3系列質(zhì)粒的組蛋白突變elp3△菌株進行染色質(zhì)免疫沉淀，以Input DNA和沉淀DNA作模板進行特異引物的PCR，確定組蛋白特定乙酰化、甲基化位點突變對Elp3的功能和SSA3、GAL1等基因轉(zhuǎn)錄的影響。 結(jié)果：1、在供試的各條件下，H4K8、H3K14以及H4K8/H3K14三種組蛋白乙?；稽c突變株的生長

5、情況均不如野生型；其中雙突變株D814生長最慢，特定條件下單突變株s8均比S14稍慢，S8的GAL1表達明顯慢于S14。表明組蛋白H4K8和H3K14的乙?；揎棇毎S持正常生長非常重要。可能H4K8的修飾比H3K14作用更大。 2、在供試的各條件下，三種組蛋白甲基化位點突變株的生長情況均不如野生型；其中雙突變株D436生長最慢，單突變株S4比S36稍慢。其GALI基因表達情況與表型基本一致。表明組蛋白H3K4和36的甲基化修