乙醇及其代謝產(chǎn)物對心肌祖細(xì)胞的毒性及H3K9表突變作用.pdf

1、目的:
　　 孕期酒精暴露可導(dǎo)致先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD,簡稱先心病),但其具體機(jī)制目前仍不清楚。我們前期研究提示組蛋白乙酰化修飾失衡可引起心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常(即表突變,Epimutation),可能與先心病發(fā)生有關(guān)。目前研究表明,乙醇可選擇性引起體外培養(yǎng)肝細(xì)胞組蛋白H3第9位賴氨酸(Histone H3 lysine9,H3K9)乙?；揎検Ш?但是否引起心臟中的H3K9乙酰

2、化修飾失衡以及進(jìn)一步影響心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)(即H3K9表突變)仍不清楚。本研究以心肌祖細(xì)胞15-13(Cardiac progenitor cells15-13,CP15-13)為研究對象,探討乙醇及其代謝產(chǎn)物對心肌祖細(xì)胞的毒性及H3K9表突變作用。
　　 材料與方法:
　　 以CP15-13為研究對象,復(fù)蘇細(xì)胞后,用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞貼滿瓶底80％左右時(shí)以1:3比例傳代,取第四代細(xì)胞做

3、干預(yù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用MTT比色法觀察乙醇及其代謝產(chǎn)物對心肌祖細(xì)胞的毒性作用及篩選出低、高濃度干預(yù)組。劑量設(shè)計(jì)為乙醇50,100,200mM,乙醛及乙酸均設(shè)計(jì)為4,8,12,16mM。低、高濃度干預(yù)CP15-13后,應(yīng)用Western blot方法檢測CP15-13干預(yù)前后組蛋白H3K9乙?；礁淖?。應(yīng)用基于SYBR GREENⅠ的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)

4、方法檢測CP15-13心臟發(fā)育相關(guān)基因GATA4、Mef2c、Tbx5 mRNA表達(dá)量在干預(yù)前后的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示50 mM乙醇(0.368±0.028)、4 mM乙醛(0.336±0.040)、4 mM乙酸(0.359±0.014)與對照組(0.358±0.066)比較不影響心肌祖細(xì)胞增殖(P>0.05),作為低濃度干預(yù)組,200 mM乙醇(0.245±0.042)、12 mM乙醛(0.2

5、20±0.017)、16 mM乙酸(0.243±0.024)與對照組(0.358±0.066)比較,對心肌祖細(xì)胞抑制率為30％左右(P<0.05),作為高濃度干預(yù)組。
　　 2.MTT篩選出低、高濃度干預(yù)CP15-13后,應(yīng)用Western blot法及Q-PCR法分別對組蛋白H3K9乙?；郊靶呐K發(fā)育相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行對比,結(jié)果顯示低濃度組乙醇、乙酸分別使組蛋白H3K9乙?；缴?.4、2.2倍(P<0.05)

6、,心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)無明顯變化(P>0.05),高濃度組乙醇、乙酸分別使組蛋白H3K9乙?；缴?.3、5.6倍,同時(shí)心臟發(fā)育相關(guān)基因GATA4表達(dá)分別增加(1.767±0.173)、(1.518±0.133),Mef2c表達(dá)分別增加(3.301±0.465)、(1.875±0.587),與對照組及相應(yīng)低濃度組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),乙醛則無論低濃度還是高濃度對組蛋白H3K9乙?；郊盎虮磉_(dá)均無明顯影響(P>0.0