腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和活性的影響及PI3K-Akt在內(nèi)皮祖細(xì)胞分化中作用的研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和活性的影響及PI3KAkt在內(nèi)皮祖細(xì)胞分化中作用的研究姓名：馬穎申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：楊向紅20080501酰肌醇一3(羥基)激酶(Phosphatidylinositol一3(hydroxyl)hnase，P13K)為生長因子受體超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要成員，可受多種細(xì)胞因子和理化因素激活。絲／蘇氨酸蛋白激酶B(Ser／Thrpro

2、tein虹I瑚eB，Akt)是位于P13K下游的一個重要激酶，二者均是促進細(xì)胞生存和維持細(xì)胞正常功能關(guān)鍵的信息分子，并且共同構(gòu)成細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程中促進細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞重要功能的信號傳遞鏈。實驗方法1、EPCs的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定采用Ficoll密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁篩選法從大鼠骨髓分離EPCs；收集培養(yǎng)5d的EPCs，用激光共聚焦顯微鏡鑒定，ACl33和vWF雙染陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。2、EPCs增殖的檢

3、測消化收集貼壁EPCs；以5x103／孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每孔體積2009l；放入37。C、5％C02的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)卜2h；待細(xì)胞基本融合，加入無血清DMEM作用12h；加入不同體積分?jǐn)?shù)(O％、10％、20％、40％)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液；檢測時，每孔加入20肛1MTT(5mg／m1)孵育4h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入1509lDMSO，微量振蕩器震蕩10min，置酶標(biāo)儀測OD490值。3、EPCs遷移的檢測以5X104／d室的細(xì)胞

4、數(shù)加入孔徑為089m的Transwell小室的上室，體積1009l，將6009l不同體積分?jǐn)?shù)(O％、10％、20％、40％)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入Transwell小室的下室；檢測時，PBS沖洗3遍，用棉簽擦拭膜上表面未遷移的細(xì)胞；100％甲醇固定膜下表面，蘇木素染色；將膜切下，用中性樹膠封固于載玻片上；在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。4、EPCs管腔形成的檢測以5X105／孔的細(xì)胞數(shù)接種于涂有Matrigel的