2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
   周圍神經(jīng)損傷是一種很發(fā)生率較高的致殘因素,周圍神經(jīng)一旦損傷,功能恢復(fù)十分緩慢,甚至?xí)斐捎谰玫墓δ苷系K。因此,周圍神經(jīng)損傷后的治療和康復(fù)研究是擺在廣大醫(yī)學(xué)工作者面前的一大難題,不論是病理機(jī)制還是治療手段,都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
   周圍神經(jīng)由結(jié)締組織和神經(jīng)構(gòu)成。結(jié)締組織和神經(jīng)的聯(lián)系相當(dāng)密切。由于終板離胞體較遠(yuǎn),神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突一般都非常細(xì)而長(zhǎng)。軸突之間彼此隔離而又成簇生長(zhǎng)。神經(jīng)軸突的保護(hù)主要有三

2、層結(jié)締組織,由內(nèi)而外分別稱為神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜。神經(jīng)束膜包繞神經(jīng)軸突、雪旺細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)膜而形成神經(jīng)束。神經(jīng)外膜包繞幾條神經(jīng)束而形成神經(jīng)。
   神經(jīng)損傷后機(jī)體修復(fù)的第一步則是神經(jīng)元胞體的增大、尼氏小體的崩解、細(xì)胞核移至細(xì)胞周邊,并啟動(dòng)相關(guān)蛋白合成。由于遠(yuǎn)端神經(jīng)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)障礙甚至中斷,細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)、液化,軸突脫髓鞘崩解,于是出現(xiàn)周圍神經(jīng)特征性的Wallerian退變。
   當(dāng)Wallerian退變過(guò)程一開(kāi)始,局部雪

3、旺細(xì)胞即被激活,開(kāi)始增殖。同時(shí),在損傷部位出現(xiàn)大量募集的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞主要由血液中的單核細(xì)胞趨化而來(lái)。損傷部位局部的雪旺細(xì)胞和募集的巨噬細(xì)胞將吞噬軸突和髓鞘碎片。髓鞘碎片的清除對(duì)于神經(jīng)的修復(fù)十分重要,因?yàn)樗枨屎休S突生長(zhǎng)的抑制因子,很有可能妨礙神經(jīng)再生。周圍神經(jīng)損傷后,雪旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用,對(duì)神經(jīng)再生具有非常重要的意義。
   Wallerian退變使得遠(yuǎn)端的軸突和髓鞘退變而崩解,但雪旺細(xì)胞卻很少壞死。周圍神經(jīng)在再生修

4、復(fù)過(guò)程中,雪旺細(xì)胞具有非常重要的作用。研究表明,雪旺細(xì)胞不僅可以清除Wallerian退變崩解的產(chǎn)物和使髓鞘再形成,還能表達(dá)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的多種營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子,并對(duì)軸突起到黏附和趨化生長(zhǎng)的作用。
   神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一。周圍神經(jīng)損傷后,雪旺細(xì)胞大量增殖并分泌NGF,在損傷的局部形成高濃度的NGF而促進(jìn)神經(jīng)再生。Laminin是雪旺細(xì)胞基質(zhì)膜的主要成分,能調(diào)控雪旺細(xì)胞的存活與功能,引導(dǎo)雪旺細(xì)胞從高濃

5、度向低濃度處遷移。因此,雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后的作用是多樣性的,能在周圍神經(jīng)損傷后形成對(duì)神經(jīng)修復(fù)再生有利的微環(huán)境,促進(jìn)神經(jīng)再生。
   另一方面,機(jī)體組織和器官時(shí)刻接受著各種不同性質(zhì)的力學(xué)刺激。物理力學(xué)刺激加載于器官,可以在細(xì)胞及基因水平影響其功能。機(jī)體的細(xì)胞在承受各種力學(xué)刺激的同時(shí),也對(duì)這些刺激做出各種生物化學(xué)的、生物力學(xué)的以及生物電生理的反應(yīng)。這些反應(yīng)在細(xì)胞水平對(duì)組織和器官造成各種不同的影響。
   實(shí)驗(yàn)證明,力學(xué)

6、刺激加載于細(xì)胞能產(chǎn)生多種影響,包括細(xì)胞的定向分化、影響細(xì)胞增殖和遷移、增加細(xì)胞外基質(zhì)的形成、改變細(xì)胞排列以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,增強(qiáng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等。
   同樣地,周圍神經(jīng)在不同情況下承受著不同程度的力學(xué)刺激,包括周圍神經(jīng)在行使其正常功能時(shí),為調(diào)節(jié)各種姿勢(shì)和動(dòng)作,也承受著多種力學(xué)刺激。在正常生理情況下,周圍神經(jīng)所受的力學(xué)刺激大概可以分為三種:擠壓力、剪切力和拉伸力。由于擠壓力和剪切力作用于周圍神經(jīng)的研究模式還不是很成熟,或是這兩種

7、作用力對(duì)于神經(jīng)的作用比壓力較復(fù)雜,所以通常對(duì)于拉伸應(yīng)力研究得比較多。
   目前,拉伸應(yīng)力加載在神經(jīng)功能康復(fù)、神經(jīng)延長(zhǎng)術(shù)等領(lǐng)域研究廣泛。因此,充分研究正常和損傷的神經(jīng)的生物力學(xué)屬性以及日?;顒?dòng)所引起的力學(xué)應(yīng)變,有利于診斷疾病和指導(dǎo)物理治療。
   拉伸應(yīng)力加載可以平行或者垂直于神經(jīng)長(zhǎng)軸施加于神經(jīng),引起相應(yīng)的縱向或者橫向的壓力。由縱向拉伸應(yīng)力引起的神經(jīng)長(zhǎng)度改變叫做拉伸形變(strain),以延長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。神經(jīng)在拉伸的

8、過(guò)程中,橫截面積減小。有理論模型研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)神經(jīng)處于拉伸應(yīng)力情況下,神經(jīng)外面包裹的結(jié)締組織管或結(jié)締組織鞘對(duì)神經(jīng)的生物力學(xué)特性有十分重要的影響。結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)改變能夠影響神經(jīng)的順應(yīng)性。影響神經(jīng)順應(yīng)性的因素有很多,比如神經(jīng)束的數(shù)量,束膜外結(jié)締組織的橫截面積等等。另外,拉伸速度、拉伸力維持的時(shí)間以及重復(fù)拉伸都能改變神經(jīng)的順應(yīng)性。
   全身的非特異性結(jié)締組織與神經(jīng)緊密聯(lián)系,相互影響,組成了一個(gè)遍布全身的“信息網(wǎng)絡(luò)”,對(duì)機(jī)體全身功能活動(dòng)

9、進(jìn)行調(diào)控。而巨噬細(xì)胞也是筋膜結(jié)締組織中的重要細(xì)胞成分,且在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室既往也對(duì)巨噬細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)研究,但都是在靜態(tài)培養(yǎng)條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。本課題組前期研究也表明,拉伸刺激能夠使筋膜結(jié)締組織重構(gòu),并在基因水平對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生影響。此外,有研究表明拉伸應(yīng)力也能影響雪旺細(xì)胞的增殖、基因表達(dá)。然而,拉伸應(yīng)力加載于與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響?這個(gè)疑問(wèn)至今無(wú)人解答。本研究,我們采用

10、雪旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)模型,能更好地模擬周圍神經(jīng)受損后的內(nèi)環(huán)境,并采用周期性拉伸應(yīng)力加載,在細(xì)胞增殖和遷移以及基因表達(dá)方面進(jìn)行探索。
   目的:
   研究腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應(yīng)力對(duì)RSC96細(xì)胞的影響,為周期性拉伸應(yīng)力干預(yù)周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。
   方法:
   1.為獲取巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液,向SD大鼠腹膜腔內(nèi)注射DMEM/F12培養(yǎng)液約10 ml,約10 m

11、in后抽出腹膜腔細(xì)胞懸液,離心后接種于培養(yǎng)板,用差速貼壁法獲得腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞。采用CD68和CD11b對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。每隔8小時(shí)收集其培養(yǎng)上清液,儲(chǔ)存以供共培養(yǎng)使用。
   2.將RSC96大鼠雪旺細(xì)胞均勻接種在六孔拉伸培養(yǎng)板上,分為四組:A組:RSC96(對(duì)照組),B組:共培養(yǎng)組,C組:拉伸組,D組:拉伸共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)指RSC96雪旺細(xì)胞株與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)。拉伸即周期性拉伸應(yīng)力加載。

12、r>   周期性拉伸應(yīng)力加載采用Flexcell FX-5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)。本次實(shí)驗(yàn)使用圓柱形應(yīng)力加載平臺(tái),提供雙軸向應(yīng)力,由系統(tǒng)自帶的電腦軟件對(duì)應(yīng)力進(jìn)行參數(shù)控制。具體設(shè)置為:正弦波,025Hz,最大拉伸形變?yōu)?%,每次持續(xù)時(shí)間1小時(shí),每隔12小時(shí)拉伸一次。拉伸組一共拉伸處理5次。
   3.于第3天收集各組細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)每組細(xì)胞的增殖情況。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm處各孔的吸光

13、值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行每組細(xì)胞遷移能力測(cè)試,在處理前、后分別使用相差顯微鏡隨機(jī)視野拍照,用ImageJ軟件進(jìn)行結(jié)果分析。
   4.用Trizol法提取總RNA,進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每組細(xì)胞所含NGF和Laminin的mRNA含量。
   5.用Western Blot法檢測(cè)每組細(xì)胞所含NGF和Laminin蛋白的表達(dá)情況,用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。
   6.重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果應(yīng)用SPSS13

14、.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)所測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊,組間比較則用LSD檢驗(yàn),方差不齊選用Dunnett's T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05認(rèn)為有顯著差異。
   結(jié)果:
   1.流式細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示,表達(dá)CD68和CD11b的細(xì)胞占90%,達(dá)到滿意的陽(yáng)性率。說(shuō)明這種方法是獲得腹腔巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)便可靠方法。
   2.四組細(xì)胞于第3天進(jìn)行MTT檢測(cè),

15、細(xì)胞增殖結(jié)果顯示拉伸共培養(yǎng)組最高,拉伸組>共培養(yǎng)組>對(duì)照組。經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析,顯示組間比較有顯著差異(F=28.833,P=0.000)。后續(xù)LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)處理組與對(duì)照組相比,均具有顯著差異(P值分別為0.034,0.000,0.000)。說(shuō)明腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液與RSC96雪旺細(xì)胞共培養(yǎng),以及5%的拉伸形變的周期性拉伸應(yīng)力加載對(duì)RSC96雪旺細(xì)胞都具有明顯的促進(jìn)增殖的作用。處理組進(jìn)行兩兩

16、比較,B、C兩組間C組高于B組,具有顯著差異(P=0.009)。這說(shuō)明在5%的拉伸形變的周期性拉伸應(yīng)力對(duì)RSC96雪旺細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用要優(yōu)于共培養(yǎng)。B組和D組比較,D組高于B組,有顯著差異(P=0.000)。同樣說(shuō)明,在腹腔巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)條件下,周期性拉伸應(yīng)力加載能明顯促進(jìn)RSC96雪旺細(xì)胞的增殖。而C、D兩組比較發(fā)現(xiàn),D組高于C組,具有顯著差異(P=0.026),說(shuō)明同樣在周期性拉伸應(yīng)力加載條件下,共培養(yǎng)組增殖比單純應(yīng)力加載要

17、明顯。這兩個(gè)結(jié)果也證明,周期性拉伸應(yīng)力的加載和腹腔巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)對(duì)于RSC96雪旺細(xì)胞的增殖,兩者可能具有協(xié)同效應(yīng)。
   3.為了測(cè)試不同處理組的細(xì)胞遷移情況,我們進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)3天不同的處理之后,四組與處理前相比,空白面積顯著減少(P=0.000)。B、C、D組空白區(qū)域面積值與A組相比,均顯著減少(P=0.000),說(shuō)明細(xì)胞遷移明顯增強(qiáng)。One-way ANOVA進(jìn)行組間比較,顯示有顯著差異(F=571.670,

18、P=0.000)。進(jìn)一步進(jìn)行LSD檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),除了處理后的B、C兩組之間相比,P=0.063(P>0.05)外,其余兩兩比較均有顯著差異(P=0.000)。說(shuō)明巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)和周期性拉伸應(yīng)力加載都對(duì)RSC96雪旺細(xì)胞的遷移具有促進(jìn)作用,但其效應(yīng)可能沒(méi)有明顯的差別。然而D組與B、C兩組比較均有顯著差異(P=0.000),D組高于B、C兩組,說(shuō)明這兩種處理?xiàng)l件對(duì)雪旺細(xì)胞的遷移可能具有協(xié)同促進(jìn)作用。
   4.經(jīng)過(guò)3天不同的處理,分

19、別用qPCR和Western blot法檢測(cè)每組所含NGF的mRNA和蛋白表達(dá)。qPCR結(jié)果表明各組均比A組高,并具有顯著性差異(P值分別為0.002,0.006,0.002)。同時(shí),B、C、D三組NGF蛋白表達(dá)相比,均比A組高,也具有顯著差異(P=0.000)。說(shuō)明腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應(yīng)力加載都能顯著提高NGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示B組和C、D組之間沒(méi)有顯著性差異,P值分別為0.463和0.948。

20、C組和D組之間也沒(méi)有顯著差異,P=0.502。Western blot檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)B、C、D三組之間NGF蛋白表達(dá)有顯著差異(P=0.000),D組表達(dá)最高,C組高于B組,說(shuō)明周期拉伸應(yīng)力加載促進(jìn)NGF蛋白的表達(dá)效應(yīng)可能要優(yōu)于共培養(yǎng),這兩種處理因素對(duì)RSC96細(xì)胞的NGF蛋白表達(dá)可能具有協(xié)同促進(jìn)作用。
   5.經(jīng)過(guò)3天不同的處理,分別用qPCR和Western blot法檢測(cè)每組所含Laminin的mRNA和蛋白表達(dá)。qPCR結(jié)

21、果顯示B、C、D三組細(xì)胞Laminin的mRNA表達(dá)與A組相比,均比A組表達(dá)高,并具有顯著差異(P值分別為0.003,0.005,0.000)。B、C兩組之間比較P=0.736,兩者沒(méi)有顯著性差異。而D組分別和B、C兩組相比,有顯著差異,P值分別為0.049,0.028。Western blot結(jié)果用LSD法進(jìn)行各組間比較,均有顯著性差異(P=0.000)。說(shuō)明巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應(yīng)力加載條件下,均能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞Lamin

22、in的表達(dá)。巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)和周期性拉伸應(yīng)力對(duì)雪旺細(xì)胞Laminin表達(dá)可能具有協(xié)同促進(jìn)作用。
   結(jié)論:
   1.腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液與RSC96雪旺細(xì)胞共培養(yǎng),能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和遷移,并能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞表達(dá)NGF和Laminin。
   2.周期性拉伸應(yīng)力加載于RSC96雪旺細(xì)胞,能能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和遷移,并能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞表達(dá)NGF和Laminin。
   3.巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

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