血管內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)、分化、鑒定及其促募集、分化的蛋白研究.pdf

1、研究目的： 利用免疫磁珠分離法獲取人臍血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化、鑒定的研究；利用腫瘤組織建立血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外促募集、分化模型，雙向蛋白電泳分析其促血管內(nèi)皮祖細(xì)胞募集、分化的蛋白成分。 研究?jī)?nèi)容和方法: 第一部分人臍血來(lái)源血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)、分化和鑒定特性研究在剖腹產(chǎn)過(guò)程中采集胎盤端的臍帶血，采用密度梯度離心法獲取臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞；分別利用CD34和CD133免疫磁珠試劑盒進(jìn)行分選，獲取CD3

2、49<'+>、CD133<'+>血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，行臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血中CD34<'+>、CD133<'+>細(xì)胞含量和所獲取的CD34<'+>、CD133<'+>細(xì)胞純度；分別用EBM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)CD34<'+>、CD133<'+>細(xì)胞，觀察血管內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)、分化情況，培養(yǎng)7天后，進(jìn)行DIL-LDL和FITC-LECTIN攝取實(shí)驗(yàn)、CD34和Ⅷ因子免疫組化鑒定，將剛分離獲取的、培養(yǎng)4天、培養(yǎng)7天的CD34<'+

3、>和CD133<'+>細(xì)胞和HLNECs分別行體外血管生成實(shí)驗(yàn)，比較CD34<'+>和CD133<'+>血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)特性；分別用EBM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)CD34<'->和CD133<'->細(xì)胞，觀察免疫磁珠分選后剩余細(xì)胞生長(zhǎng)、分化情況，培養(yǎng)7天后行CD34和Ⅷ因子免疫組化鑒定；分別將CD34<'+>細(xì)胞和單核細(xì)胞凍存于液氮中，分別于凍存3、6、12、18個(gè)月時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞，行臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性，分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后行CD34和Ⅷ

4、因子免疫組化鑒定及形成內(nèi)皮細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，比較不同凍存時(shí)間對(duì)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞活性及增殖能力的影響。 第二部分人臍血來(lái)源血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外促募集、分化模型建立使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌BEL-7402細(xì)胞，將BEL-7402細(xì)胞消化后，重懸于PBS液中，按10<'7>個(gè)細(xì)胞/只的量注射于10～14g的雌性裸鼠頸后皮下部位；觀察裸鼠注射位置的腫瘤生長(zhǎng)情況；當(dāng)腫瘤組織生長(zhǎng)達(dá)直徑1cm，即行手術(shù)切除腫瘤組織；實(shí)驗(yàn)組中，將部分腫瘤組織行石蠟

5、切片及HE染色檢查；將腫瘤組織切成2mm小塊，置于Transwell上室培養(yǎng)，下室接種免疫磁珠分選獲取的CD133<'+>細(xì)胞，進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)照組中則不加入腫瘤組織進(jìn)行培養(yǎng)，期間分別收集兩組培養(yǎng)液，凍存待用；兩組使用同一培養(yǎng)液培養(yǎng)至7天，分別行DIL-LDL和FITC-LECTIN攝取實(shí)驗(yàn)、CD34和Ⅷ因子免疫組化鑒定。 第三部分促血管內(nèi)皮祖細(xì)胞募集、分化的蛋白研究將上一步分所獲取的兩組培養(yǎng)液，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)超濾濃縮、去除高豐度

6、蛋白及蛋白純化；再經(jīng)蛋白定量后，進(jìn)行CyDye熒光標(biāo)記，蛋白加樣進(jìn)行常規(guī)2-DE和2D-DIGE分離。2-DE凝膠深紫熒光染色來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，使用ImageMaster軟件進(jìn)行表達(dá)圖譜分析；2D-DIGE凝膠中預(yù)先被Cydye染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)多功能激光掃描儀不同波長(zhǎng)的激光掃描后，獲取熒光膠內(nèi)差異表達(dá)圖譜，使用DeCyder軟件分析。 研究結(jié)果: 1.CD34<'+>和CD34<'+>細(xì)胞數(shù)量、純度及細(xì)胞活性經(jīng)密

7、度梯度離心法獲取的單核細(xì)胞中，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34<'+>細(xì)胞和CD133<'+>細(xì)胞含量為(1.18±0.84)﹪、(1.15±0.086)﹪，經(jīng)免疫磁珠分選獲取的兩者數(shù)量為(7.27±0.69)× 10<'6>、(9.26±0.47)× 10。，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定兩者純度為(79.43±2.62)﹪、(91.45±1.04)﹪，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定兩者活細(xì)胞百分比為(94.85±2.36)﹪、(91.4±2.01)﹪。 2.C

8、D133<'+>、CD34<'+>細(xì)胞體外培養(yǎng)特性培養(yǎng)24h內(nèi)細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞逐漸形成梭形。在培養(yǎng)5～7d，團(tuán)狀生長(zhǎng)的梭形血管內(nèi)皮細(xì)胞形成局部典型的集落。 行Dil-LDL及FITC-Lectin攝取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果經(jīng)顯微鏡觀察絕大部分細(xì)胞均可見(jiàn)為雙染陽(yáng)性。CD34<'+>細(xì)胞雙染陽(yáng)性率與CD133<'+>細(xì)胞兩組行t檢驗(yàn)，無(wú)顯著差異。行細(xì)胞免疫組化檢測(cè)CD34及Ⅷ因子表達(dá)情況，結(jié)果大多數(shù)細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)CD34及Ⅷ因子。CD34

9、<'+>細(xì)胞和CD133<'+>細(xì)胞及HLJVECs組間每100個(gè)細(xì)胞平均陽(yáng)性率比較均無(wú)顯著差異。 體外血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①剛分離的CD34<'+>和CD133<'+>細(xì)胞無(wú)明顯管狀結(jié)構(gòu)形成；②培養(yǎng)4天后的CD34<'+>和CD133<'+>細(xì)胞可形成少數(shù)管狀結(jié)構(gòu)，兩者無(wú)顯著差異；③培養(yǎng)7天的CD34<'+>和CD133<'+>細(xì)胞形成較多管狀結(jié)構(gòu)，兩組無(wú)顯著差異；④HUVECs接種后形成管狀結(jié)構(gòu)，分別與培養(yǎng)1w的CD34<'+

10、>細(xì)胞和CD133<'+>細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果無(wú)顯著差異。 3.CD133<'->細(xì)胞及CD34<'->細(xì)胞體外培養(yǎng)特性部分細(xì)胞逐漸胞體伸展、變大，逐漸形成梭形。細(xì)胞形態(tài)呈多樣化，有圓形、梭形等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在培養(yǎng)5～7d，可見(jiàn)團(tuán)狀生長(zhǎng)的梭形血管內(nèi)皮細(xì)胞形成局部典型的集落。分別行細(xì)胞免疫組化檢測(cè)CD34及Ⅷ因子表達(dá)情況。結(jié)果僅少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD34及Ⅷ因子。 4.凍存對(duì)于EPCs影響的比較凍存3、6、12、18個(gè)月的單核

11、細(xì)胞和CD34<'+>細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，結(jié)果示不同凍存時(shí)間對(duì)于兩種細(xì)胞的活細(xì)胞比例沒(méi)有明顯的影響；不同凍存時(shí)間的單核細(xì)胞和CD34<'+>細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)體外培養(yǎng)，結(jié)果示不同凍存時(shí)間對(duì)于兩種細(xì)胞的集落形成數(shù)量有影響；兩種細(xì)胞形成的梭形細(xì)胞經(jīng)免疫組化證實(shí)為陽(yáng)性表達(dá)CD34和Ⅷ因子。 5.裸鼠腫瘤組織模型建立Bel-7402細(xì)胞注射至裸鼠皮下，3～6天后可于裸鼠皮下有結(jié)節(jié)生成，隨著觀察時(shí)間推移，皮下結(jié)節(jié)也隨著增大。經(jīng)石蠟切片和

12、HE染色后顯微鏡下觀察，所獲取的腫瘤組織的細(xì)胞學(xué)形態(tài)與惡性腫瘤相近似。 6.腫瘤促血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)EPCs形成梭形，并有梭形細(xì)胞集落形成，行Dil-LDL及FITC-Lectin攝取實(shí)驗(yàn)：Dil-LDL、FITC-Lectin攝取實(shí)驗(yàn)示大部分細(xì)胞均可見(jiàn)為雙染陽(yáng)性，免疫組化實(shí)驗(yàn)示大部分細(xì)胞呈陽(yáng)性；對(duì)照組的EPCs貼壁生長(zhǎng)后，大部分細(xì)胞沒(méi)有明顯形態(tài)變化，僅有少量細(xì)胞胞體伸展、變長(zhǎng)，沒(méi)有細(xì)胞集落形成。 Dil-LD

13、L及FITC-Lectin攝取實(shí)驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)僅少部分細(xì)胞陽(yáng)性；兩組間差異顯著。 7.雙向蛋白電泳分析促EPCs募集、分化蛋白2D-DIGE分析結(jié)果進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，成功鑒定出71種差異蛋白質(zhì)，從中篩選出屬于實(shí)驗(yàn)組組上調(diào)的蛋白質(zhì)7類：表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白、PDZand LIM domain protein 5、ETS-1蛋白、熱休克蛋白60、順烏頭酸酶、G蛋白偶聯(lián)受體6。 結(jié)論: 1.CD3

14、4和CD133標(biāo)記的免疫磁珠分選法是高效獲取EPCs的有效途徑； 2.CD34<'+>和CD133<'+>血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)特性相近； 3.體外凍存時(shí)間影響血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化能力； 4.利用Transwell系統(tǒng)可成功建立腫瘤組織促血管內(nèi)皮祖細(xì)胞募集、分化模型； 5.2D-DIGE是靈敏度和可信度非常高的蛋白質(zhì)組學(xué)分離、檢測(cè)技術(shù)，是尋找和鑒定促EPCs募集、分化作用蛋白質(zhì)的有效方法； 6.表