幼兒肺泡上皮和血管內皮祖細胞分離培養(yǎng)技術探討.pdf

1、研究背景：
　　肺泡Ⅱ型上皮細胞(Alveolar epithelial typeⅡ cells，AECⅡ)是肺泡上皮的祖細胞，能夠變?yōu)棰裥头闻萆掀ぜ毎麉⑴c肺損傷修復，分泌肺泡表面活性物質(Pulmonary surfactant，PS)維持肺泡穩(wěn)定性、防止肺泡萎陷、保持肺的順應性，能夠將肺泡上皮頂端膜面的鈉、水轉運至肺間質，并參加了肺對各種吸入有害物質及微生物的天然免疫等。AECⅡ僅占肺部細胞的15％，對肺組織或肺混合細胞的培養(yǎng)

2、難以明確AECⅡ的具體功能。目前尚無具有全部AECⅡ功能的細胞系，AECⅡ的原代培養(yǎng)成為解決這一問題的重要手段。以往研究大多是對成年大鼠、小鼠和兔AECⅡ的分離培養(yǎng)研究，也有少量新生動物細胞分離培養(yǎng)報道，但細胞產量均較低，此外由于小動物生長發(fā)育周期及生理病理過程短，生理及解剖特點也不利于長期動物實驗研究，對于人新生兒至嬰幼兒期的生理和病理生理學研究適用性有限。本研究的目的是建立新生豬AECⅡ分離、純化及鑒定方法，為AECⅡ的生物學特性研

3、究及與AECⅡ有關的在體動物實驗研究奠定基礎。
　　目的：
　　1、建立新生豬AECⅡ的分離、純化及鑒定方法；
　　2、觀察AECⅡ的體外生長變化特點，明確其體外實驗的最佳時間。
　　方法：
　　1、取體重1000-1300 g足月新生豬肺，經(jīng)氣道灌入0.1％胰酶及不同濃度彈力蛋白酶與0.1％胰酶的混合酶溶液(40 u/ml elatase/0.1％trypsin、30 u/mlelatase/0.1％tr

4、ypsin、20 u/ml elatase/0.1％trypsin)37℃、20 min水浴消化，收集細胞、計數(shù)細胞產量及活力；
　　2、采用percoll非連續(xù)密度梯度離心及免疫粘附法純化(即panning法)細胞，計數(shù)細胞產量及活力；
　　3、采用透射電鏡法、堿性磷酸酯酶染色法鑒定.AECⅡ；
　　4、將細胞以4×105cells/cm2接種于組織培養(yǎng)板，用DMEM低糖培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100 u/ml青霉

5、素、0.1g/ml鏈霉素)進行培養(yǎng)，每24 h換液，觀察細胞生長變化情況。
　　5、在相同的消化條件下：0.1％胰酶、37℃、20 min水浴消化條件下，對比研究免疫粘附法、pcrcoll非連續(xù)密度梯度離心法純化細胞后所獲得大鼠、新生豬AECⅡ的產量、活力及純度的差別。
　　結果：
　　1、新生豬肺組織細胞的消化分離：30 u/ml彈力蛋白酶/0.1％胰酶消化肺組織后細胞產量(5.35±0.54)×106，而20 u/

6、ml彈力蛋白酶/0.1％胰酶消化細胞產量為(3.16±0.94)×106，40 u/ml彈力蛋白酶/0.1％胰酶消化細胞產量為(3.09±0.86)×106，0.1％胰酶消化細胞產量為(2.76±0.65)×106，30 u/ml彈力蛋白酶/0.1％胰酶消化細胞產量顯著高于其他3組(P<0.01)；
　　2、新生豬肺.AECⅡ的純化：免疫粘附法純化后的細胞產量為(37.97±27.98)×106，percoll非連續(xù)密度梯度離心法

7、純化細胞的產量(11.07±10.59)×106，前者明顯高于后者；
　　3、新生豬肺AECⅡ的培養(yǎng)：原代培養(yǎng)24 h，AECⅡ開始貼壁，細胞呈圓形、多角形，呈島狀分布。培養(yǎng)至48 h，細胞形態(tài)一致，為多角形。第3-4天細胞平展，連接成細胞單層，胞漿內有大量反差明顯的小顆粒，細胞核明顯。第5-7天，細胞內顆粒逐漸減少，胞漿空泡，細胞體積增大，邊緣模糊。AECⅡ在原代培養(yǎng)24-96 h處于最佳狀態(tài)，此階段適合作體外實驗研究。

8、　　4、在相同消化、分離及純化方法條件下，新生豬肺AECⅡ的純化產量明顯高于大鼠AECⅡ純化產量。大鼠AECⅡ的pereoll法純化細胞產量顯著高于免疫黏附法。新生豬AECⅡ的純化，免疫粘附法產量則明顯高于pereoll法。純化后大鼠AECⅡ的陽性率近90％，而新生豬AECⅡ的陽性率僅為70％左右。
　　結論：
　　1、新生豬AECⅡ消化分離的最佳消化條件是：30 u/ml彈力蛋白酶/0.1％胰酶聯(lián)合使用，37℃、20 mi