骨髓來源血管內(nèi)皮前體細胞在不同培養(yǎng)條件下增殖分化能力的觀察.pdf

1、實驗?zāi)康?EPCs可以有效的介導(dǎo)缺血組織的新生血管生成,具有廣泛的臨床應(yīng)用價值,但目前尚未有成熟的EPCs分離和擴增方法,而且目前國際上用于分離和培養(yǎng)EPCs的方法造價極高,勢必影響EPCs在中國的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用,故該實驗旨在尋找一種簡便、經(jīng)濟、有效的分離、純化和擴增EPCs的方法,為其進一步的基礎(chǔ)或臨床研究提供條件.實驗方法第一部分:內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下骨髓來源單核細胞中EPCs的增殖和分化.在無菌的條件下抽取大鼠骨髓,用密度梯度離

2、心法分離骨髓單核細胞,將細胞分為三組,接種在添加不同濃度ECGS的基礎(chǔ)內(nèi)皮培養(yǎng)基中:A組:含ECGS 300ug/ml;B組:含ECGS 200 ug/ml;C組:含ECGS 100ug/ml.在培養(yǎng)的前中后期,用細胞計數(shù)板檢測培養(yǎng)細胞數(shù)目,流式細胞儀檢測CD34、vWF和eNOS的陽性細胞百分比.至培養(yǎng)終點,將細胞進行原位免疫熒光染色,標記vWF和eNOS,在熒光顯微鏡下觀察.第二部分:在內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下添加不同影響因素對EPC

3、s的增殖和分化的影響.同第一部分分離大鼠骨髓單核細胞,將細胞分為三組,分別接受不同處理:A組:與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)共培養(yǎng);B組:在內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加生長因子VEGF、bFGF;C組:僅應(yīng)用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng).在培養(yǎng)的前中后期,用細胞計數(shù)板檢測細胞數(shù)目,流式細胞儀檢測CD34,vWF和eNOS的陽性細胞百分比.結(jié)論1、新分離出的骨髓單核細胞CD34+細胞百分比為(42.3~47.1)％,說明其中復(fù)含EPCs,極少量的細胞表達

4、vWF和eNOS,說明新分離的骨髓單核細胞中分化成熟的內(nèi)皮細胞數(shù)量少.2、應(yīng)用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以促進骨髓單核細胞中EPCs的增殖和分化.EPCs的增殖能力有ECGS的濃度依賴性,以300ug/ml為佳,200ug/ml有較好的效價比.3、與僅用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比,與HUVEC細胞共培養(yǎng)或在培養(yǎng)基中添加生長因子VEGF和bFGF均可促進骨髓來源單核細胞中EPCs的增殖和分化,其中以添加生長因子的刺激作用最強,與HUVEC共培養(yǎng)在一定程度上