胃癌干樣細(xì)胞向內(nèi)皮前體細(xì)胞分化的研究.pdf

1、胃癌嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康,據(jù)衛(wèi)生部資料統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年胃癌死亡人數(shù)占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的23.2％,是我國(guó)惡性腫瘤致死的最重要原因。胃癌主要的治療方式有手術(shù)、放療和化療等,近年來血管靶向治療因其特異性強(qiáng)、聯(lián)合放化療療效佳而受到青睞,但其日益產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重影響了患者療效,是我們研究亟待解決的問題。腫瘤血管生成的方式存在多種,目前應(yīng)用的包括阿伐斯汀在內(nèi)的血管靶向藥物主要針對(duì)VEGF通路,阻斷內(nèi)皮祖細(xì)胞成熟為內(nèi)皮細(xì)胞,但是腫瘤本身及其間質(zhì)內(nèi)

2、可能有其他細(xì)胞和通路參與了腫瘤血管生成過程,進(jìn)而產(chǎn)生不同程度抗腫瘤血管靶向治療的耐藥。而這也是導(dǎo)致阿伐斯汀等血管靶向藥物有效率相對(duì)較低的主要原因,有效率僅有20%到37%。因此研究腫瘤血管形成的來源及機(jī)制對(duì)發(fā)現(xiàn)抗腫瘤血管治療新靶點(diǎn),降低抗血管靶向治療耐藥具有重要意義。腫瘤干細(xì)胞(Cancerstemcell,CSC)的異質(zhì)性,可塑性導(dǎo)致其功能的多樣性,它通過用各種方式為腫瘤提供全方面的生長(zhǎng)條件。2011年《自然》雜志首先提出腫瘤內(nèi)發(fā)生染

3、色體變異的內(nèi)皮細(xì)胞由腫瘤干細(xì)胞分化而來,這可能是腫瘤內(nèi)部血管生成的一種重要方式。近年來文獻(xiàn)報(bào)道在血管較豐富的神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)部,70%的內(nèi)皮細(xì)胞由腫瘤干細(xì)胞分化而來。那么胃癌腫瘤干細(xì)胞是否參與了向內(nèi)皮前體細(xì)胞分化的過程,是否是腫瘤內(nèi)部血管生成的一個(gè)主要來源,這個(gè)轉(zhuǎn)化過程中涉及的分子機(jī)制有哪些,研究清楚這些問題會(huì)讓我們對(duì)胃癌血管的發(fā)生,發(fā)展有更全面的認(rèn)識(shí),從而為胃腫瘤血管靶向治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　目的:
　　1、誘導(dǎo)鑒定胃癌

4、腫瘤干樣細(xì)胞(CancerStemLikeCells,CSLCs),2、研究胃癌腫瘤干樣細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞體外分化的表型及功能,3、研究胃癌腫瘤干樣細(xì)胞體內(nèi)生成微血管的潛能。
　　方法:
　　1、誘導(dǎo)胃腫瘤干樣細(xì)胞:流式細(xì)胞儀分選帶有綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)標(biāo)記的胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞,長(zhǎng)春新堿預(yù)篩選后,以每孔200個(gè)細(xì)胞接種到低粘附96孔板中,采用含有表皮生長(zhǎng)因子(Epide

5、rmalGrowthFactor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BasicFibroblastGrowthFactor,b-FGF)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(亦即培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件),三周后得到SGC7901來源的腫瘤干樣細(xì)胞:2、鑒定胃腫瘤干樣細(xì)胞:利用腫瘤干細(xì)胞的高致瘤性,通過最低克隆球數(shù)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證誘導(dǎo)的胃癌腫瘤干樣細(xì)胞的成瘤性,以達(dá)到鑒定胃癌腫瘤干樣細(xì)胞的目的;3、表型驗(yàn)證:將經(jīng)過鑒定的一部分細(xì)胞,在含有內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

6、(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)等血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的M200培養(yǎng)液中培養(yǎng),通過Westernblot、細(xì)胞免疫熒光方法對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901組,腫瘤干樣細(xì)胞組,內(nèi)皮環(huán)境下刺激腫瘤干樣細(xì)胞組,原代內(nèi)皮細(xì)胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HuVEC)組這四組細(xì)胞檢測(cè)內(nèi)皮標(biāo)志CD31,CD34的表達(dá)情況;4、體外功能實(shí)驗(yàn):四組細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)誘導(dǎo)的腫瘤干樣

7、細(xì)胞在內(nèi)皮環(huán)境的刺激后,是否具有內(nèi)皮特性,能否形成管樣結(jié)構(gòu);5、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn):經(jīng)鑒定的另一部分細(xì)胞,進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。10只裸鼠左右分別接種5×106個(gè)SGC7901和5×106個(gè)CSLCs,4周后取腫瘤,做大小重量統(tǒng)計(jì)分析;6、移植瘤石蠟包埋,免疫組織化學(xué)分析:人源血管內(nèi)皮標(biāo)志hCD31、hCD34染色,人胃癌組織設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照,SGC7901細(xì)胞成瘤組織設(shè)為陰性對(duì)照,腫瘤干樣細(xì)胞成瘤組織為實(shí)驗(yàn)組,觀察移植瘤內(nèi)部人源性微血管的形

8、成。
　　結(jié)果:
　　1.胃癌腫瘤干樣細(xì)胞球形克隆的培養(yǎng)及成瘤能力的鑒定
　　成功誘導(dǎo)胃癌腫瘤干樣細(xì)胞:經(jīng)3周誘導(dǎo)得到SGC7901來源的胃癌CSLCs在低粘附培養(yǎng)板中形成克隆球,形態(tài)均一,生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1)。200個(gè),1000個(gè)球形克隆分別接種于4-6周齡裸鼠兩側(cè)皮下,4周后裸鼠狀態(tài)良好,左右兩側(cè)均有移植瘤形成(圖2),此實(shí)驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)誘導(dǎo)的胃癌CSLCs具有顯著的成瘤能力。
　　2.體外驗(yàn)證胃癌腫瘤干樣細(xì)胞向

9、內(nèi)皮分化的表型及功能
　　Westernblot分析,實(shí)驗(yàn)組為胃癌CSLCs組和內(nèi)皮環(huán)境下刺激CSLCs組,SGC7901組設(shè)為陰性對(duì)照,HUVEC組為陽(yáng)性對(duì)照。收集各組細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Westernblot檢測(cè),結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)胃癌CSLCs組和陰性對(duì)照SGC7901組內(nèi)皮細(xì)胞蛋白幾乎無表達(dá),而內(nèi)皮環(huán)境下刺激的CSLCs組CD31,CD34的表達(dá)和陽(yáng)性對(duì)照HUVEC組相比無明顯差異。用ChemiDocXRS+ImagingSys

10、tem(Bio-Rad)進(jìn)行條帶掃描,QuantityOnev4.6.2software(Bio-Rad)軟件進(jìn)行灰度分析,內(nèi)皮環(huán)境下刺激的CSLCs組內(nèi)皮表面蛋白CD31,CD34表達(dá)明顯升高,與內(nèi)皮環(huán)境刺激之前CSLCs和陰性對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。
　　利用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)CD31,CD34蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,接受VEGF的刺激后,內(nèi)皮標(biāo)志物CD31,CD34在CSLCs的表達(dá)與刺激之前相比,細(xì)胞膜CD31,

11、CD34表達(dá)量明顯提高,且形態(tài)為圓形或橢圓形,邊界清楚,細(xì)胞核染色無明顯變化(圖4)。證實(shí)內(nèi)皮環(huán)境的特異性誘導(dǎo)可以明顯促進(jìn)CSLCs中內(nèi)皮標(biāo)志蛋白的表達(dá),這提示CSLCs的多向分化潛能,在VEGF等特定微環(huán)境的誘導(dǎo)下可向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　成管實(shí)驗(yàn)分組與上述實(shí)驗(yàn)分組情況相同,結(jié)果顯示:HUVEC在Matrigel基質(zhì)膠上形成明顯管腔樣結(jié)構(gòu),SGC7901細(xì)胞無變化,而CSLCs在內(nèi)皮環(huán)境的刺激后較無刺激的CSLCs具有較強(qiáng)的成管能

12、力(圖5)。
　　3.體內(nèi)驗(yàn)證胃癌腫瘤干樣細(xì)胞的內(nèi)皮分化潛能
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)10只4-6周齡裸鼠,分兩組皮下分別接種SGC7901細(xì)胞(5×106個(gè))和CSLCs(5×106個(gè))。4周后,取出腫瘤,進(jìn)行大小重量統(tǒng)計(jì)分析:SGC7901移植瘤組腫瘤大小為0.5cm-0.8cm、重量0.3g-1.0g,CSLCs移植瘤組腫瘤大小為1.0cm-2.0cm、重量1.0g-2.5g(圖6)。移植瘤石蠟包埋,免疫組化分析結(jié)果顯示,在CSL

13、Cs移植瘤的組織切片用人源性血管內(nèi)皮標(biāo)志hCD31和hCD34染色,結(jié)果可觀察到明確的人源性微血管形成,而在SGC7901細(xì)胞成瘤組織切片中未見人緣性內(nèi)皮細(xì)胞(圖7,8)。提示在移植瘤的內(nèi)環(huán)境中由腫瘤干樣細(xì)胞逐漸向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化,在腫瘤內(nèi)部形成腫瘤干細(xì)胞來源的微血管。
　　結(jié)論:
　　本課題成功誘導(dǎo)并鑒定SGC7901來源的胃癌腫瘤干樣細(xì)胞。通過表型和功能的研究初步證實(shí)在體外內(nèi)皮環(huán)境的刺激下,胃癌腫瘤干樣細(xì)胞具有向內(nèi)皮分化的潛