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1、上皮性卵巢癌(epithelialovariancarcinoma,EOC)是女性第五大致命的腫瘤。EOC病變的發(fā)展特點(diǎn)以局部浸潤(rùn)和直接播散為主,早期階段也能出現(xiàn)盆、腹腔的轉(zhuǎn)移,因此目前很多研究認(rèn)為EOC的臨床特點(diǎn)與局部腫瘤微環(huán)境免疫缺陷具有密切的相關(guān)性。 腫瘤微環(huán)境是指腫瘤局部由腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)與機(jī)體免疫系統(tǒng)之間相互作用所形成的免疫網(wǎng)絡(luò),目前對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究主要集中在眾多的細(xì)胞因子,樹突狀細(xì)胞(dendriticcell
2、,DC)、T細(xì)胞、及NK細(xì)胞等,并認(rèn)為這些細(xì)胞因子和細(xì)胞在腫瘤免疫耐受中起重要作用。 很多研究表明,腫瘤微環(huán)境中通??梢奣h1/Th2/Th3類細(xì)胞因子表達(dá)失平衡,在抑制細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到重要作用。而這種失衡主要表現(xiàn)為免疫抑制性Th2類細(xì)胞因子表達(dá)異常升高。但目前對(duì)升高的Th2類細(xì)胞因子的來源尚未完全清楚,對(duì)是否由EOC細(xì)胞異常分泌所致的直接證據(jù)仍有爭(zhēng)議。90%以上的EOC起源于正常卵巢上皮(ovariansu
3、rfaceepithelium,OSE)。與OSE的功能相關(guān),它們也能夠產(chǎn)生各種細(xì)胞因子,但對(duì)來源于OSE的EOC細(xì)胞與OSF所產(chǎn)生的細(xì)胞因子是否存在差異所知甚少。 DC是腫瘤微環(huán)境中最重要免疫細(xì)胞之一。很多研究表明,DC系統(tǒng)的缺陷是腫瘤逃逸的主要因素,這些缺陷能通過不同的途徑引起腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的缺陷。DC是生物體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞,DC具有多種分類,其中最為常見的是分為髓樣DC(myeloiddendritic
4、cells,mDC)和漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoiddendriticcell,pDC)。前者誘導(dǎo)免疫反應(yīng),后者誘導(dǎo)免疫耐受。在腫瘤微環(huán)境中DC功能缺陷表現(xiàn)為成熟功能的DC數(shù)量下降,未成熟DC的聚集,以及具有免疫抑制功能的pDC增多。但是目前對(duì)腫瘤患者體內(nèi)mDC的減少和pDC的增多機(jī)制并未明確。已有實(shí)驗(yàn)提供的直接或間接證據(jù)表明,在腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)DC的分化、成熟和激活。但對(duì)EOC細(xì)胞是否也有此類作用尚
5、不清楚,由EOC細(xì)胞產(chǎn)生的Th2類因子是否也參與這一過程尚有待闡明。因此,了解EOC細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的特征對(duì)明確卵巢癌患者體內(nèi)異常升高的Th2類細(xì)胞因子的來源,并探究其對(duì)DC分化成熟及功能的影響,對(duì)闡明卵巢癌微環(huán)境免疫缺陷形成機(jī)制有極其重要的意義。 本研究首先應(yīng)用細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)并臨床驗(yàn)證EOC細(xì)胞和OSE細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的差異;再通過體外建立的DC細(xì)胞分化培養(yǎng)模型,探究EOC培養(yǎng)上清對(duì)CD34+造血干細(xì)胞來源的DC前體細(xì)胞
6、分化的影響;最后經(jīng)抗體中和實(shí)驗(yàn)觀察卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在卵巢癌細(xì)胞影響DC前體細(xì)胞分化中的作用,旨在闡明EOC細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子誘導(dǎo)卵巢癌微環(huán)境免疫缺陷的機(jī)制,為完善針對(duì)EOC的DC疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分上皮性卵巢癌細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)差異的研究 目的: 檢測(cè)并驗(yàn)證EOC細(xì)胞與OSE細(xì)胞之間細(xì)胞因子表達(dá)的差異。 材料與方法: 采用細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)檢測(cè)兩種EOC
7、細(xì)胞株(SKOV3和CaoV3)、原代培養(yǎng)的EOC細(xì)胞和原代培養(yǎng)的OSE細(xì)胞之間的細(xì)胞因子表達(dá)差異。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)EOC患者腹水、血清和良性婦科腫瘤患者腹腔液、血清中LIF、IL-10、IL-4和TGF—β1的表達(dá)。 結(jié)果: 細(xì)胞因子芯片檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),EOC細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)水平超過OSE培養(yǎng)上清(2倍以上)的有LIF、IL-10和IL-4。LIF和IL-10在EOC患者腹水中的水平較良性婦科腫瘤患
8、者腹腔液顯著升高(P=0.02,P=0.001),但未在任一腹水或血清樣本中檢測(cè)到IL-4表達(dá),EOC和良性婦科腫瘤患者的TGF—β1表達(dá)無顯著差異。 結(jié)論: 上皮性卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生更多的免疫抑制性細(xì)胞因子LIF、IL-10和IL-4,從而導(dǎo)致部分細(xì)胞因子在患者體內(nèi)水平增高。 第二部分上皮性卵巢癌細(xì)胞影響DC前體細(xì)胞分化的體外研究 目的: 證實(shí)上皮性卵巢癌細(xì)胞在體外能引起DC前體細(xì)胞異常分化,并導(dǎo)致
9、成熟DC功能缺陷。 材料與方法: 用FLT-3L和SCF擴(kuò)增來自CD34+造血干/祖細(xì)胞的DC前體細(xì)胞。用GM—CSF和TNF—α培養(yǎng)誘導(dǎo)成熟的DC。在培養(yǎng)過程中加入EOC細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)上清,以研究其對(duì)于Lin—CD45RA—DC前體細(xì)胞分化和成熟的影響。流式細(xì)胞檢測(cè)用以分析DC細(xì)胞的分群和表面分子標(biāo)記。同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)增殖測(cè)定用以檢測(cè)DC的刺激活性。用ELISA檢測(cè)IL-12的分泌。 結(jié)
10、果: Lin—CD45RA—DC前體細(xì)胞在GM—CSF和TNF—α的培養(yǎng)下產(chǎn)生兩群DC細(xì)胞:HLA—DR+CD11C+CD123—髓樣DCs(mDCs)和HLA—DR+CD11C—CD123+漿細(xì)胞樣DCs(pDCs)。與單純的培養(yǎng)基及OSE培養(yǎng)上清相比較,在SKOV3培養(yǎng)上清的作用下,mDC的數(shù)量下降,而pDC的數(shù)量增加。不論有無SKOV3培養(yǎng)上清,DC細(xì)胞成熟標(biāo)記HLA—DR和CD80的表達(dá)無顯著差異。但是在SKOV3培養(yǎng)上
11、清的作用下,DC的對(duì)于CD3+T細(xì)胞的增殖刺激能力及分泌IL-12的能力均顯著下降。 結(jié)論: 上皮性卵巢癌細(xì)胞抑制Lin—CD45RA—DC前體細(xì)胞向mDC分化成熟、促進(jìn)向pDC分化成熟,同時(shí)使成熟DC的免疫活性受損。 第三部分細(xì)胞因子在卵巢癌細(xì)胞影響DC前體細(xì)胞分化和功能中的作用 目的: 探明卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在卵巢癌細(xì)胞影響DC前體細(xì)胞分化和功能過程中所起的作用。 材料與方法:
12、 用FLT-3L和SCF擴(kuò)增來自CD34+造血干/祖細(xì)胞的DC前體細(xì)胞,用GM—CSF和TNF—α培養(yǎng)誘導(dǎo)成熟的DC。在培養(yǎng)過程中設(shè)置空白組,加SKOV3上清組,加SKOV3上清的同時(shí)加入抗IL-10和抗LIF抗體組,及空白組中加入細(xì)胞因子IL-10和LIF組合組。研究細(xì)胞因子對(duì)Lin—CD45RA—DC前體細(xì)胞分化和成熟的影響。流式細(xì)胞檢測(cè)用以分析DC細(xì)胞的分群和表面分子標(biāo)記。同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測(cè)定用以檢測(cè)DC的刺激活性。
13、用ELISA檢測(cè)IL-12的分泌。 結(jié)果: 在空白組培養(yǎng)基中加入IL-10+LIF,DC表達(dá)的HLA—DR和CD80較其余組別顯著下降,且能夠降低培養(yǎng)系統(tǒng)中mDC的比例,增高pDC的比例,并降低對(duì)CD3+T細(xì)胞的增殖刺激能力及IL-12的分泌。而在SKOV3培養(yǎng)上清中加入抗IL-10+LIF細(xì)胞因子抗體,不能逆轉(zhuǎn)SKOV3上清所致的Dc前體細(xì)胞異常分化及刺激T細(xì)胞增殖能力降低的作用。 結(jié)論: 1、細(xì)胞因子
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