上皮性卵巢癌細胞誘導樹突狀細胞前體細胞亞群分化異常的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌(epithelialovariancarcinoma，EOC)是女性第五大致命的腫瘤。EOC病變的發(fā)展特點以局部浸潤和直接播散為主，早期階段也能出現(xiàn)盆、腹腔的轉(zhuǎn)移，因此目前很多研究認為EOC的臨床特點與局部腫瘤微環(huán)境免疫缺陷具有密切的相關性。 腫瘤微環(huán)境是指腫瘤局部由腫瘤細胞、細胞外基質(zhì)與機體免疫系統(tǒng)之間相互作用所形成的免疫網(wǎng)絡，目前對腫瘤微環(huán)境的研究主要集中在眾多的細胞因子，樹突狀細胞(dendriticcell

2、，DC)、T細胞、及NK細胞等，并認為這些細胞因子和細胞在腫瘤免疫耐受中起重要作用。 很多研究表明，腫瘤微環(huán)境中通?？梢奣h1/Th2/Th3類細胞因子表達失平衡，在抑制細胞介導的特異性抗腫瘤免疫反應中起到重要作用。而這種失衡主要表現(xiàn)為免疫抑制性Th2類細胞因子表達異常升高。但目前對升高的Th2類細胞因子的來源尚未完全清楚，對是否由EOC細胞異常分泌所致的直接證據(jù)仍有爭議。90％以上的EOC起源于正常卵巢上皮(ovariansu

3、rfaceepithelium，OSE)。與OSE的功能相關，它們也能夠產(chǎn)生各種細胞因子，但對來源于OSE的EOC細胞與OSF所產(chǎn)生的細胞因子是否存在差異所知甚少。 DC是腫瘤微環(huán)境中最重要免疫細胞之一。很多研究表明，DC系統(tǒng)的缺陷是腫瘤逃逸的主要因素，這些缺陷能通過不同的途徑引起腫瘤微環(huán)境中T細胞的缺陷。DC是生物體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細胞，DC具有多種分類，其中最為常見的是分為髓樣DC(myeloiddendritic

4、cells，mDC)和漿細胞樣DC(plasmacytoiddendriticcell，pDC)。前者誘導免疫反應，后者誘導免疫耐受。在腫瘤微環(huán)境中DC功能缺陷表現(xiàn)為成熟功能的DC數(shù)量下降，未成熟DC的聚集，以及具有免疫抑制功能的pDC增多。但是目前對腫瘤患者體內(nèi)mDC的減少和pDC的增多機制并未明確。已有實驗提供的直接或間接證據(jù)表明，在腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞及其產(chǎn)生的細胞因子能調(diào)節(jié)DC的分化、成熟和激活。但對EOC細胞是否也有此類作用尚

5、不清楚，由EOC細胞產(chǎn)生的Th2類因子是否也參與這一過程尚有待闡明。因此，了解EOC細胞表達細胞因子的特征對明確卵巢癌患者體內(nèi)異常升高的Th2類細胞因子的來源，并探究其對DC分化成熟及功能的影響，對闡明卵巢癌微環(huán)境免疫缺陷形成機制有極其重要的意義。 本研究首先應用細胞因子芯片技術檢測并臨床驗證EOC細胞和OSE細胞表達細胞因子的差異；再通過體外建立的DC細胞分化培養(yǎng)模型，探究EOC培養(yǎng)上清對CD34+造血干細胞來源的DC前體細胞

6、分化的影響；最后經(jīng)抗體中和實驗觀察卵巢癌細胞產(chǎn)生的細胞因子在卵巢癌細胞影響DC前體細胞分化中的作用，旨在闡明EOC細胞及其產(chǎn)生的細胞因子誘導卵巢癌微環(huán)境免疫缺陷的機制，為完善針對EOC的DC疫苗的研發(fā)提供實驗依據(jù)。 第一部分上皮性卵巢癌細胞與正常卵巢上皮細胞細胞因子表達差異的研究 目的： 檢測并驗證EOC細胞與OSE細胞之間細胞因子表達的差異。 材料與方法： 采用細胞因子抗體芯片技術檢測兩種EOC

7、細胞株(SKOV3和CaoV3)、原代培養(yǎng)的EOC細胞和原代培養(yǎng)的OSE細胞之間的細胞因子表達差異。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測EOC患者腹水、血清和良性婦科腫瘤患者腹腔液、血清中LIF、IL-10、IL-4和TGF—β1的表達。 結果： 細胞因子芯片檢測結果發(fā)現(xiàn)，EOC細胞培養(yǎng)上清中表達水平超過OSE培養(yǎng)上清(2倍以上)的有LIF、IL-10和IL-4。LIF和IL-10在EOC患者腹水中的水平較良性婦科腫瘤患

8、者腹腔液顯著升高(P=0.02，P=0.001)，但未在任一腹水或血清樣本中檢測到IL-4表達，EOC和良性婦科腫瘤患者的TGF—β1表達無顯著差異。 結論： 上皮性卵巢癌細胞產(chǎn)生更多的免疫抑制性細胞因子LIF、IL-10和IL-4，從而導致部分細胞因子在患者體內(nèi)水平增高。 第二部分上皮性卵巢癌細胞影響DC前體細胞分化的體外研究 目的： 證實上皮性卵巢癌細胞在體外能引起DC前體細胞異常分化，并導致

9、成熟DC功能缺陷。 材料與方法： 用FLT-3L和SCF擴增來自CD34+造血干/祖細胞的DC前體細胞。用GM—CSF和TNF—α培養(yǎng)誘導成熟的DC。在培養(yǎng)過程中加入EOC細胞株SKOV3培養(yǎng)上清，以研究其對于Lin—CD45RA—DC前體細胞分化和成熟的影響。流式細胞檢測用以分析DC細胞的分群和表面分子標記。同種異體混合淋巴細胞反應(MLR)增殖測定用以檢測DC的刺激活性。用ELISA檢測IL-12的分泌。 結

10、果： Lin—CD45RA—DC前體細胞在GM—CSF和TNF—α的培養(yǎng)下產(chǎn)生兩群DC細胞：HLA—DR+CD11C+CD123—髓樣DCs(mDCs)和HLA—DR+CD11C—CD123+漿細胞樣DCs(pDCs)。與單純的培養(yǎng)基及OSE培養(yǎng)上清相比較，在SKOV3培養(yǎng)上清的作用下，mDC的數(shù)量下降，而pDC的數(shù)量增加。不論有無SKOV3培養(yǎng)上清，DC細胞成熟標記HLA—DR和CD80的表達無顯著差異。但是在SKOV3培養(yǎng)上

11、清的作用下，DC的對于CD3+T細胞的增殖刺激能力及分泌IL-12的能力均顯著下降。 結論： 上皮性卵巢癌細胞抑制Lin—CD45RA—DC前體細胞向mDC分化成熟、促進向pDC分化成熟，同時使成熟DC的免疫活性受損。 第三部分細胞因子在卵巢癌細胞影響DC前體細胞分化和功能中的作用 目的： 探明卵巢癌細胞產(chǎn)生的細胞因子在卵巢癌細胞影響DC前體細胞分化和功能過程中所起的作用。 材料與方法：

12、 用FLT-3L和SCF擴增來自CD34+造血干/祖細胞的DC前體細胞，用GM—CSF和TNF—α培養(yǎng)誘導成熟的DC。在培養(yǎng)過程中設置空白組，加SKOV3上清組，加SKOV3上清的同時加入抗IL-10和抗LIF抗體組，及空白組中加入細胞因子IL-10和LIF組合組。研究細胞因子對Lin—CD45RA—DC前體細胞分化和成熟的影響。流式細胞檢測用以分析DC細胞的分群和表面分子標記。同種異體混合淋巴細胞反應測定用以檢測DC的刺激活性。

13、用ELISA檢測IL-12的分泌。 結果： 在空白組培養(yǎng)基中加入IL-10+LIF，DC表達的HLA—DR和CD80較其余組別顯著下降，且能夠降低培養(yǎng)系統(tǒng)中mDC的比例，增高pDC的比例，并降低對CD3+T細胞的增殖刺激能力及IL-12的分泌。而在SKOV3培養(yǎng)上清中加入抗IL-10+LIF細胞因子抗體，不能逆轉(zhuǎn)SKOV3上清所致的Dc前體細胞異常分化及刺激T細胞增殖能力降低的作用。 結論： 1、細胞因子