microRNA在耳蝸前體細(xì)胞增殖和分化中的作用探討.pdf

1、在耳科學(xué)領(lǐng)域，探索耳蝸的發(fā)育機制和毛細(xì)胞的再生機制是兩個具有挑戰(zhàn)性的難題。在新生的鼠類耳蝸內(nèi)，仍然能夠分離和培養(yǎng)出具有增殖能力的前體細(xì)胞，這些耳蝸前體細(xì)胞（CPCs）在體外能夠分化出耳蝸毛細(xì)胞以及其他種類的耳蝸細(xì)胞。這些前體細(xì)胞被認(rèn)為可能應(yīng)用于毛細(xì)胞損傷缺失后的替代治療，更重要的是，在體外誘導(dǎo)分化這些前體細(xì)胞可以為我們提供一個研究耳蝸發(fā)育和毛細(xì)胞再生的體外模型。
　　microRNA（miRNA）是一類能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及干

2、細(xì)胞命運的內(nèi)源性非編碼小RNA。目前尚無關(guān)于miRNA在耳蝸前體細(xì)胞增殖和分化中表達(dá)和功能的研究。在本研究中，我們首次利用微芯片及實時定量PCR等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了在CPCs分化過程中表達(dá)的全部miRNA及其表達(dá)模式，與神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)比較后，發(fā)現(xiàn)miR-183家族具有CPC細(xì)胞表達(dá)特異性。這些結(jié)果表明miRNA可能在CPC的增殖和分化中發(fā)揮了不同的作用，還可能決定了CPC向毛細(xì)胞的定向分化。
　　使CPCs過表達(dá)目的miRNA或目

3、的miRNA的互補反義鏈可以分別通過“gain-of-function”和“l(fā)oss-of-function”實現(xiàn)對miRNA功能的驗證。但目前尚無成功轉(zhuǎn)染CPCs的相關(guān)報道。我們首次觀察和比較了三種不同的轉(zhuǎn)染方法對CPCs的轉(zhuǎn)染率和對細(xì)胞存活率的影響。初步證明了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是使耳蝸前體細(xì)胞過表達(dá)目的基因的最佳途徑與方法。
　　實驗一：耳蝸前體細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和分化
　　目的：分離、培養(yǎng)新生大鼠仔鼠耳蝸中的

4、前體細(xì)胞（cochlear progenitor cells，CPCs）和胚胎鼠中來源于嗅球部位的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)，并對兩種細(xì)胞進行體外誘導(dǎo)分化。
　　方法：從新生0至3天的大鼠耳蝸基底膜中分離出CPCs，進行原代培養(yǎng)，分別用免疫細(xì)胞熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測BrdU和nestin在CPCs中的表達(dá)情況，鑒定前體細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞特性。用血清誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化，用免疫細(xì)胞熒光的方法檢測CP

5、Cs是否具有分化成毛細(xì)胞的能力。從發(fā)育15天的SD大鼠胚胎鼠的嗅球中分離出NSCs，并進行傳代培養(yǎng)。用血清誘導(dǎo)傳代第4代的NSCs進行分化。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)的CPCs第18小時后可見少量細(xì)胞球形成，隨著培養(yǎng)時間的延長，可見細(xì)胞球數(shù)量逐漸增多，組成細(xì)胞球的細(xì)胞數(shù)目也增多。細(xì)胞球內(nèi)絕大部分細(xì)胞BrdU和nestin陽性。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞球的形態(tài)發(fā)生改變，增殖能力明顯下降，而且部分細(xì)胞球自行貼壁，無法進行嚴(yán)格意義上的傳代。經(jīng)

6、分化誘導(dǎo)后，細(xì)胞球貼壁生長，14天后，對分化細(xì)胞行免疫熒光化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物myosinVIIA。NSCs增殖能力非常強，可傳至少40代，持續(xù)6個月，分化后的細(xì)胞形態(tài)與CPCs來源的分化細(xì)胞顯著不同。
　　結(jié)論：本部分實驗表明CPCs具有一定的增殖能力，也可以分化出毛細(xì)胞樣細(xì)胞，但并非嚴(yán)格意義上的干細(xì)胞，只能稱其為耳蝸來源的前體細(xì)胞，它可作為耳蝸發(fā)育和毛細(xì)胞再生的體外研究模型。本部分實驗為研究和比較miRNA在

7、CPCs和NSCs分化過程中的表達(dá)變化奠定基礎(chǔ)。
　　實驗二：耳蝸前體細(xì)胞分化過程中miRNA的表達(dá)變化
　　目的：miRNA具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和影響細(xì)胞命運的重要作用。目前關(guān)于miRNA在CPCs中的表達(dá)和功能研究尚未見任何報道。我們擬用高通量的miRNA芯片檢測目前已知所有的miRNA在CPCs增殖和分化過程中的表達(dá)模式。
　　方法：收集CPCs細(xì)胞球和CPCs來源的分化6天和14天的細(xì)胞，提取總RNA，

8、通過質(zhì)量檢測后用Hy3標(biāo)記探針，用LNAmiRNA芯片進行雜交，然后掃描芯片并分析所有目前已知的miRNA的表達(dá)熒光信號強度，經(jīng)過信號標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)處理后繪制miRNA的表達(dá)模式圖。分析并比較每個miRNA在三個時間點的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：近有100個miRNA在CPCs的分化過程中可以檢測到。隨著分化的進行，大部分的miRNA都出現(xiàn)明顯的表達(dá)變化。這些miRNA之間的表達(dá)豐度跨度巨大，而且具有不同的表達(dá)模式，miR-125b-5

9、p,miR-494和miR-22是表達(dá)量最高的三個miRNA。在檢測到的miRNA中，最為常見的三種表達(dá)模式是：1.在未分化狀態(tài)下表達(dá)水平達(dá)到峰值;2.在分化第6天的時候表達(dá)水平達(dá)到峰值;3.在分化第14天的時候表達(dá)水平達(dá)到峰值。
　　結(jié)論：本部分實驗表明在CPCs不同分化階段，具有不同的miRNA表達(dá)譜系。miRNA表達(dá)水平的時序性調(diào)節(jié)變化暗示著這些miRNA在不同的分化階段發(fā)揮不同的作用。
　　實驗三：實時定量PCR技術(shù)

10、比較miRNA在不同種類細(xì)胞中的表達(dá)模式
　　目的：用miRNA時實定量RT-PCR技術(shù)驗證芯片結(jié)果，檢測miR-21、miR-503、let-7a和let-7f及miR-183家族在CPCs分化過程中的表達(dá)變化，檢測miR-183家族在NSCs分化過程中的表達(dá)變化。對比miR-183家族在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法：收集CPCs細(xì)胞球和CPCs來源的分化6天和14天的細(xì)胞，提取總RNA，用miRNAqRT-PCR技術(shù)

11、檢測miR-21、miR-503、let-7a、let-7f、miR-96、miR-182和miR-183在三個分化時間點的表達(dá)變化。收集NSCs細(xì)胞球和NSCs來源的分化6天和14天的細(xì)胞，提取總RNA，用miRNAqRT-PCR技術(shù)檢測miR-183家庭在三個分化時間點的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：miR-21、miR-503、let-7a和let-7f的表達(dá)趨勢與其在miRNA芯片中的結(jié)果基本一致。miR-21、let-7a和le

12、t-7f具有相似的表達(dá)模式，均在分化6天的時候達(dá)到峰值。而miR-503具有不同的表達(dá)模式，隨著分化的進行，miR-503的表達(dá)水平逐漸升高，在分化第14天階段表達(dá)水平達(dá)到高峰，此變化亦具有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-183家族的三個成員表達(dá)模式不同，miR-96和miR-182的表達(dá)量均隨著分化的進行不斷下降，而miR-183的表達(dá)與miR-21相似在分化6天時達(dá)到高峰。miR-96和miR-183均無法在NSCs分化過程中檢測到，miR-1

13、82僅能在未分化的NSCs中檢測到，但表達(dá)量極低。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢測，以上變化均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：本部分實驗結(jié)果表明了LNA芯片結(jié)果的可靠性。在CPCs分化中不同的miRNA可能有類似的功能。miR-183家族具有CPC的細(xì)胞表達(dá)特異性，這種特導(dǎo)性可能影響了干細(xì)胞向CPCs的分化，也可能決定了CPCs向多種耳蝸細(xì)胞的特異性分化。
　　實驗四：耳蝸前體細(xì)胞過表達(dá)目的基因方法的建立
　　目的：能夠使CPCs過表達(dá)或低表

14、達(dá)miRNA是驗證miRNA功能的首要條件。但目前尚無成功轉(zhuǎn)染CPCs的相關(guān)報道。我們分別觀察脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染和腺病毒感染三種方法對原代培養(yǎng)的CPCs的轉(zhuǎn)染率。為日后研究miRNA在CPCs中發(fā)揮的作用奠定實驗技術(shù)基礎(chǔ)。
　　方法：用不同比例的EGFP質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物和不同的孵育時間轉(zhuǎn)染CPCs;設(shè)置不同的電場強度用電穿孔轉(zhuǎn)染法將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CPCs;按照不同MOI值加入rAd-EGFP，用腺病毒介導(dǎo)的方法使CPCs

15、表達(dá)EGFP。24小時后在熒光顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞，計算轉(zhuǎn)染率。用臺盼藍(lán)拒染試驗觀察各種條件下的不同轉(zhuǎn)染法的細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果：改變不同的轉(zhuǎn)染條件后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率無明顯改變，平均轉(zhuǎn)染率低于2％，但對細(xì)胞的存活不產(chǎn)生明顯的影響;增加電穿孔的電壓后，轉(zhuǎn)染率在一定的電壓范圍內(nèi)明顯上升，在電壓強度為250V時達(dá)到最高，平均轉(zhuǎn)染率為24.7％，但是細(xì)胞存活率相對較低;腺病毒感染法的平均轉(zhuǎn)導(dǎo)率在MOI值為250時達(dá)到高峰為52％，細(xì)胞的