STAT3及SOCS3信號分子在肝前體細胞增殖分化過程中的作用.pdf

1、本文旨在探討肝衰竭組織中HPC的增殖特點及其與STAT3及SOCS3表達的關(guān)系。并進一步以大鼠肝干細胞樣上皮細胞系WB-F344(簡稱WB細胞)為研究對象，探討STAT3及SOCS3在WB-F344細胞增殖及分化過程中的作用。 研究方法： (1)采用肝衰竭組織及急、慢性輕型肝炎組織標(biāo)本共76例，病例選自1965年-2005年中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院尸檢病例、肝臟外科手術(shù)病例及肝活檢病例。所有病例肝組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石

2、蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片進行HE染色以觀察病變特點；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(S-P法)進行OV6、CK19、p-STAT3及SOCS3的檢測。 結(jié)果判定：①OV6免疫組化染色半定量：OV6陽性表達于細胞漿。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞的百分數(shù)。“-”：無HPC或有少量HPC；“+”：灶性HPC；“++”：連續(xù)性HPC，但范圍<50％匯管區(qū)和纖維間隔；“+++”：連續(xù)性HPC，但范圍>50％匯

3、管區(qū)和纖維間隔。以“-”為陰性，“+”“++”及“+++”為陽性。②CK19、p-STAT3及SOCS3免疫組化染色結(jié)果判定：每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞的百分數(shù)。CK19及SOCS3表達于細胞漿中，p-STAT3表達于細胞核，呈現(xiàn)棕色染色顆粒。無著色或陽性表達率≤25％為陰性，>25％為陽性。 (2)以大鼠肝干細胞樣上皮細胞系WB-F344細胞為研究對象，肝細胞生長因子fHepatic

4、growth factor，HGF)及JAK/STAT3通路抑制劑AG490作用于WB-F344細胞后，應(yīng)用免疫熒光及Westem blot方法檢測HGF及AG490作用后細胞STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達；應(yīng)用RT-PCR方法檢測HGF及AG490作用后細胞SOCS3 mRNA的表達；應(yīng)用流式細胞術(shù)及MTT法檢測HGF及AG490作用后細胞的細胞周期及凋亡的變化。 (3)應(yīng)用HGF、表皮生長因子(Epithe

5、lial growth factor，EGF)、胰島素及地塞米松組成誘導(dǎo)分化體系(高糖DMEM，10％胎牛血清，HGF 10-50ng/ml，EGF 20ng/ml，胰島素1μg/ml及地塞米松1μmol/l)，體外誘導(dǎo)WB-F344細胞向肝細胞定向分化。觀察分化過程中不同時點WB-F344細胞形態(tài)的變化。應(yīng)用RT-PCR方法鑒定WB-F344細胞定向分化過程中分化標(biāo)志白蛋白(Albumin，ALB)、甲胎蛋白(Alpha-1-feto

6、protein，AFP)及細胞角蛋白19(Cytokeratin，CK19)的表達。應(yīng)用Western blot方法檢測WB-F344細胞定向分化過程中STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表達；應(yīng)用RT-PCR方法檢測細胞分化過程中SOCS3 mRNA的表達。 (4)統(tǒng)計方法：所有資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： (1)CK19免疫組化染色結(jié)果表明：亞

7、急性肝衰竭((subacute liver failure，SALF)、及慢加急性(亞急性)肝衰竭((acute-on-chronic liver failure，ACLF)組織中可見大量增生的膽管，包括典型增生膽管和非典型增生膽管。肝衰竭組織的CK19陽性率(62.5％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(30％)(P<0.05)；OV6作為肝前體細胞的標(biāo)記抗體，其染色陽性的細胞主要有兩種形式。大部分是組成非典型增生膽管的管狀細胞；

8、另一種是匯管區(qū)出現(xiàn)的小肝細胞樣細胞。肝衰竭組織的OV6陽性率(85.7％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(35.0％)(P<0.05)；p-STAT3的陽性表達主要位于匯管區(qū)增生的膽管細胞、HPC、炎性細胞、竇內(nèi)皮細胞及肝細胞的細胞核中。肝衰竭組織的p-STAT3陽性率(67.9％)明顯高于急、慢性輕型肝炎的組織的陽性率(25％)(P<0.05)；SOCS3的陽性表達主要位于匯管區(qū)的增生的膽管細胞、炎性細胞及肝細胞的細胞漿中。肝衰

9、竭組織的SOCS3陽性率(60.7％)明顯高于急、慢性輕型肝炎組織的陽性率(35％)(P<0.05)_。相關(guān)分析表明，OV6的表達與CK19、p-STKT3及SOCS3的表達呈正相關(guān)(r<,s>分別為0.689，0.239及0.322，P<0.05)。 (2)STAT3水平在HGF作用于WB-F344細胞前后無明顯變化(P>0.05)；HGF能夠促進STAT3的磷酸化，p-STAT3在HGF作用10分鐘后增加，完全磷酸化發(fā)生在H

10、GF作用30分鐘，60分鐘后表達逐漸減弱。應(yīng)用AG490后p-STAT3表達減弱(P<0.05)_正常WB-F344細胞有SOCS3蛋白及mRNA表達，在HGF作用10分鐘后SOCS3表達增加，以后逐漸減弱。應(yīng)用AG490后SOCS3表達減弱(P<0.05)。HGF作用于WB-F3＃4細胞后細胞周期S期細胞數(shù)增加，G1期細胞數(shù)減少，凋亡細胞減少，這種作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。應(yīng)甩AG490后能夠抑制WB-F344細胞的增殖，促

11、進細胞凋亡。 (3)WB-F344細胞在加入分化培養(yǎng)體系2天后細胞出現(xiàn)離散效應(yīng)。實驗7天后細胞延伸并形成小梁樣結(jié)構(gòu)，細胞逐漸由六邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮巍?1天后分化為肝細胞樣梭形形態(tài)，細胞生長緩慢，形態(tài)逐漸出現(xiàn)分散。RT-PCR方法檢測表明細胞分化過程中表達肝細胞標(biāo)志ALB的水平逐漸增加，作為肝干細胞標(biāo)志之一的AFP的表達逐漸減少，CK19這一膽管細胞的表達標(biāo)志逐漸減少(P<0.05)。上述結(jié)果提示HGF、EGF、胰島素及地塞米松可以誘

12、導(dǎo)WB-F344體外向肝細胞定向分化。應(yīng)用Western blot方法檢測表明STAT3蛋白在分化過程中無明顯變化(P>0.05)：p-STAT3蛋白表達在分化過程中逐漸減少(P<0.05)；應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測表明SOCS3 mRNA及蛋白表達在分化過程中逐漸減少(P<0.05)。 研究結(jié)論: (1)肝衰竭組織中存在HPC的增殖；肝衰竭組織中p-STAT3及SOCS3的表達增加，與HPC表

13、達成正相關(guān)。提示p-STAT3及SOCS3參與肝衰竭組織中HPC增殖的調(diào)控。 (2)HGF能夠促進WB-F344細胞STAT3的磷酸化水平，增加SOCS3表達；HGF能夠促進WB細胞的增殖并抑制細胞凋亡，STAT3及SOCS3參與了這一過程的調(diào)控。 (3)HGF、EGF、胰島素及地塞米松組成的分化培養(yǎng)體系能夠體外誘導(dǎo)WB-F344細胞向肝細胞定向分化；分化過程中p-STAT3及SOCS3的表達逐漸減少，提示其可能對于抑制