Wnt信號分子在大鼠氣管干細(xì)胞增殖分化過程中的表達(dá).pdf

1、干細(xì)胞是具有保持自我復(fù)制能力且在適合微環(huán)境下具有多分化能力的原始細(xì)胞。研究干細(xì)胞可以探索人體發(fā)生發(fā)育之謎，更可望將來人工制造替代患病的組織器官。成體干細(xì)胞為最近幾年提出的新概念，成體干細(xì)胞主要分化成自身組織的細(xì)胞，與組織的生長分化修復(fù)密切相關(guān)。其中，造血、神經(jīng)、皮膚、肝臟、胰臟、前列腺、胃腸干細(xì)胞已相繼被證明。本研究組曾建立了體外觀察氣管干細(xì)胞的模型，并已證明其特點(diǎn)是未分化、對5-FU有耐藥性的Go期細(xì)胞，能排除Hoechst33342

2、染料，SP性質(zhì)可通過Bcrp1/ABCG2基因表達(dá)來證明。在氣管損傷修復(fù)過程中，涉及不同的分子信號級聯(lián)，控制干細(xì)胞的遷移、增生及分化。然而目前國內(nèi)外尚無此方面的報(bào)導(dǎo)。 Wnt蛋白是控制細(xì)胞生長、增殖的關(guān)鍵分泌信號分子，可傳遞細(xì)胞間相互調(diào)控信息。近年來研究證實(shí)，干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的互相作用需要Wnt信號途徑的參與。Wnt通過阻止β-catenin的分解，激活轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef的表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖與分化。 本研究應(yīng)用

3、蛋白印跡、RT-PCR及免疫組化方法檢測了大鼠氣管損傷修復(fù)中Wnt-1、β-catenin、Tcf-4、c-Myc基因的表達(dá)變化情況，探討Wnt信號途徑在氣管干細(xì)胞增殖分化中的重要作用，希望能對了解誘導(dǎo)氣管干細(xì)胞增殖分化的分子機(jī)制有所幫助。 方法： 1氣管損傷模型建立取大鼠氣管，剪成2-3mm寬的氣管環(huán)，分兩組。實(shí)驗(yàn)組：將氣管環(huán)置于含5-FU(12.5m/ml)的HamsF-12液中，5％CO2，37℃孵育；12小時(shí)后棄

4、去上述培養(yǎng)液，換成新鮮的HamsF-12液繼續(xù)培養(yǎng)；其后分別于0、6、12、24、48小時(shí)取部分等量組織塊。對照組：用等體積HamsF-12液代替5-FU，其余培養(yǎng)條件及取材時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組。 2.氣管上皮的損傷修復(fù)過程氣管環(huán)冠狀冰凍切片(10μm厚)，常規(guī)HE染色，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察5-FU損傷后的修復(fù)過程。 3.氣管上皮Wnt-1的表達(dá)取正常及5-FU處理的氣管粘膜上皮組織，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色及蛋白印跡法檢測氣管上皮W

5、nt-1的表達(dá)情況。 4.氣管上皮β-catenin的表達(dá)取正常及5-FU處理的氣管粘膜上皮組織，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色及蛋白印跡法檢測氣管上皮β-catenin的表達(dá)情況。 5.氣管上皮Tcf-4的表達(dá)應(yīng)用RT-PCR法檢測Tcf-4mRNA的表達(dá)，使用Trizol提取5-FU處理前后大鼠氣管上皮總RNA，引物序列如下：MDR1-F5’-GTTGTTCTTTGCGGGGAGG-3’；MDR1-R5’-TGCTGCTC

6、AGACAGTGTCGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為416bp。TaKaRa兩步法RT-PCR試劑盒檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，相同條件下，用β-actin作為內(nèi)對照，擴(kuò)增產(chǎn)物為308bp，以Kodak1D型凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)拍照。 6.氣管上皮c-Myc的表達(dá)RT-PCR法檢測c-mycmRNA的表達(dá)，Trizol提取5-FU處理前后大鼠氣管上皮總RNA，引物序列如下：MDR1-F5’-AGGTGTGATATCCGGTAGA-3

7、’；MDR1-R5’-CCTTCTAAGTGGTTGGAAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為477bp。TaKaRa兩步法RT-PCR試劑盒檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，相同條件下，用β-actin作為內(nèi)對照，擴(kuò)增產(chǎn)物為308bp，以Kodak1D型凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)拍照。 結(jié)果： 1.5-FU作用12小時(shí)后，大鼠氣管上皮細(xì)胞絕大部分脫落，暴露出基底膜，僅剩余少數(shù)較分散的間隔分布的近于裸核的氣管干細(xì)胞，呈釘狀位于基底膜上。5-F

8、U去除6小時(shí)后，氣管基底膜上可見少量扁平樣細(xì)胞。24小時(shí)后基底膜上細(xì)胞數(shù)目增加，并逐漸分化呈立方狀，連接成片。48小時(shí)氣管上皮中出現(xiàn)假復(fù)層柱狀上皮，并可見纖毛細(xì)胞。 2.免疫組織化學(xué)及蛋白定量結(jié)果顯示：正常及損傷后0小時(shí)氣管上皮極少量表達(dá)Wnt-1，損傷后6小時(shí)Wnt-1表達(dá)最強(qiáng)，其后隨時(shí)間延長，Wnt-1表達(dá)逐漸減少。 3.免疫組織化學(xué)及蛋白定量結(jié)果顯示：正常及損傷后0小時(shí)氣管上皮極少量表達(dá)β-catenin，恢復(fù)12

9、小時(shí)后β-catenin蛋白表達(dá)最強(qiáng)，而后其水平呈遞減趨勢。 4.RT-PCR法提示：5-FU作用后6小時(shí)氣管上皮較正常組Tcf-4mRNA的表達(dá)顯著增加，之后隨著修復(fù)的進(jìn)行，其表達(dá)逐漸減少。 5.RT-PCR法提示：5-FU作用后12小時(shí)氣管上皮較正常組c-MycmRNA的表達(dá)顯著增加，之后隨著修復(fù)的進(jìn)行，其表達(dá)逐漸減少。 結(jié)論： 1.本研究應(yīng)用5-FU作為損傷因素，建立了離體大鼠氣管損傷模型。該模型再

10、現(xiàn)了氣管干細(xì)胞增殖分化、修復(fù)氣管上皮的全過程。 2.Wnt-1時(shí)間依賴性表達(dá)與氣管上皮損傷修復(fù)進(jìn)程相吻合，說明其在氣管干細(xì)胞增殖分化中起重要調(diào)控作用。 3.胞漿中游離狀態(tài)的β-Catenin表達(dá)的增加可能促進(jìn)了氣管干細(xì)胞的增殖，而抑制其分化。 4.氣管損傷修復(fù)過程中Tcf-4呈時(shí)間依賴性表達(dá)，是氣管干細(xì)胞增殖分化過程中起正性調(diào)節(jié)的重要因子。 5.c-Myc基因參與氣管干細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)，其表達(dá)可能誘導(dǎo)氣