大鼠腸神經(jīng)嵴干細胞的分離培養(yǎng)材料的選擇及Wnt5a在大鼠腸神經(jīng)嵴干細胞及其分化過程中的表達.pdf

1、目的：
　　 神經(jīng)嵴干細胞（neural crest stem cells，NCSC）起源于胚胎期的神經(jīng)管背側(cè)，部分NCSC定向分化成腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，被稱為腸神經(jīng)嵴干細胞（gut neural crest stem cells，GNCSC）。GNCSC的發(fā)育異常會導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其數(shù)量、功能及分化細胞的類型在ENS發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。已有研究證實，肛

2、門直腸畸形（Anorectal Malformations，ARMs）患者術(shù)后排便功能不良的部分原因是由末端直腸的腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育異常引起，先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung's Disease，HD）為小兒外科的常見疾病，其病理基礎(chǔ)也是先天性腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的結(jié)果。GNCSC的發(fā)現(xiàn)和體外培養(yǎng)的成功，為我們利用GNCSC進行干細胞移植，從而徹底治愈先天性巨結(jié)腸及解決肛門直腸畸形患兒術(shù)后便失禁等問題提供了一個很好的前景。
　　

3、 雖然近些年來關(guān)于GNCSC體外培養(yǎng)的文章不在少數(shù)，但是在GNCSC的分離提取及培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟上說法模糊，對于材料的選擇也沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本實驗旨在完善GNCSC體外的培養(yǎng)方法，比較從不同胎齡大鼠胚胎及生后新生大鼠提取的GNCSC體外培養(yǎng)形成的神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)（neurosphere-like bodies，NLB）生長情況，探討最佳的取材時機及培養(yǎng)方法。
　　 近年的文獻證實Wnt蛋白通過不同信號分子間的相互作用，觸發(fā)了調(diào)節(jié)細胞

4、生長、遷移、分化及發(fā)育等多方面的復(fù)雜信號級聯(lián)反應(yīng)，其中對Wnt5a的研究正在逐漸增多，Wnt5a在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細胞的增殖分化中起重要作用，本文通過免疫熒光染色技術(shù)研究Wnt5a在GNCSC增殖及分化過程中的表達情況，研究Wnt5a在ENS形成及發(fā)育過程的可能調(diào)節(jié)作用。
　　 實驗方法：
　　 1、不同胎齡大鼠GNCSC的分離培養(yǎng)、鑒定及比較
　　 分別在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第17天（E17）、第

5、19天（E19），第21天（E21）剖宮取出胎鼠，和生后2天（P2）大鼠，利用顯微外科手術(shù)器械取其腸管做GNCSC原代培養(yǎng)。待NLB出現(xiàn)后進行傳代培養(yǎng)，并利用傳代5-7天后的GNCSC做免疫熒光鑒定。比較不同胎齡胎鼠GNCSC體外培養(yǎng)形成的NLB的生長情況。
　　 2、Wnt5a在GNCSC增殖及分化過程中的表達
　　 提取E19天大鼠胚胎GNCSC，將傳代培養(yǎng)后6天的GNCSC分為5組。第1組直接爬片進行免疫熒光染色，

6、另外5組利用含血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，并于誘導(dǎo)分化開始后第1天、3天、5天、7天進行Wnt5a的免疫熒光染色。
　　 結(jié)果：
　　 1、比較不同胎齡及生后提取的GNCSC形成神經(jīng)球的時間發(fā)現(xiàn)，E17、E19提取的GNCSC于原代后第3天形成神經(jīng)球，E21，P2提取的GNCSC于提取后第5天形成。
　　 2、在GNCSC中及GNCSC分化后第1天均發(fā)現(xiàn)Wnt5a有較強表達，第3天表達較弱，第5-7天幾乎無表達。