大鼠腸神經(jīng)干細(xì)胞特性及在消化道移植研究.pdf

1、目的：神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腸神經(jīng)元發(fā)育缺陷性疾病是一種潛在的、具有臨床應(yīng)用前景的根治方法，腸神經(jīng)干細(xì)胞（Enteric neural stem cells, ENSCs）可能是合適的移植干細(xì)胞源。從動物和人類提取ENSCs的研究剛剛起步；ENSCs與目前研究較成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的神經(jīng)干細(xì)胞（Central nervous system-derived neural stem cells，CNS-NSCs）之間的生物學(xué)特性差異尚未闡明；

2、在進(jìn)入臨床試驗(yàn)以前，ENSCs在活體消化道移植后能否生存、能否達(dá)到移植目的需要深入實(shí)驗(yàn)研究。本文擬從胚胎大鼠消化道提取神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)傳代，比較研究ENSCs和 CNS-NSCs的生物學(xué)特性，同時開展ENSCs同種消化道內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，為今后進(jìn)一步ENSCs的移植應(yīng)用提供依據(jù)。 方法： ①采用改良的ENSCs培養(yǎng)液配方和分離技術(shù)，以神經(jīng)球形成法從孕20天SD大鼠腸道提取神經(jīng)干細(xì)胞。 ②進(jìn)行Nestin、TUJ-

3、1、GFAP和SMA免疫組化染色，以確定提取的細(xì)胞是否為ENSCs。 ③借助CD49d和P75免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞儀技術(shù)，測定原代培養(yǎng)前后ENSCs的含量。 ④從同一胞胎大鼠分離培養(yǎng)ENSCs和CNS-NSCs，通過神經(jīng)球生長直接觀察法、CCK-8細(xì)胞增殖測定法、免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞儀測定技術(shù)及酶組織化學(xué)方法，比較研究兩者的生長和增殖情況、成熟分化特性、Ret及神經(jīng)遞質(zhì)nNOS和AchE表達(dá)的差異。 ⑤應(yīng)用PKH

4、-26標(biāo)記ENSCs后，進(jìn)行幼SD大鼠結(jié)腸和幽門壁移植實(shí)驗(yàn)。 ⑥利用冰凍切片免疫熒光和圖像重建技術(shù)，觀察移植術(shù)后3、7、14天，ENSCs在受體腸壁內(nèi)存活、分化和遷移情況。 結(jié)果： ①通過我們使用的分離培養(yǎng)方法，原代培養(yǎng)8-10天后，形成懸浮生長的腸神經(jīng)球。 ②培養(yǎng)的腸神經(jīng)球可反復(fù)傳代增殖，陽性表達(dá)Nestin，能分化成表達(dá)TUJ-1的神經(jīng)元、表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及表達(dá)SMA的平滑肌樣細(xì)胞，確認(rèn)為

5、ENSCs。 ③CD49d和P75雙標(biāo)流式細(xì)胞儀測得原代培養(yǎng)前后ENSCs的含量分別為7.8％和22.9％。 ④與CNS-NSCs相比，每天生長觀察發(fā)現(xiàn)ENSCs神經(jīng)球增殖速度要慢于CNS-NSCs，神經(jīng)球表面常有長突起，并相互連接成網(wǎng)絡(luò)狀，顯示早期成熟分化的跡象；CCK-8法測得ENSCs的吸光度明顯低于CNS-NSCs（P＜0.05），也顯示其增殖速度慢于CNS-NSCs。 ⑤流式細(xì)胞儀測得ENSCs和CNS

6、-NSCs的TUJ-1陽性細(xì)胞比例分別為12.3％和11.4％（P﹥0.05）、GFAP陽性細(xì)胞比例分別為21.7％和22.5％（P﹥0.05）、Nestin 陽性細(xì)胞比例分別為10.8％和10.8％（P﹥0.05），差別均無顯著性，說明兩者有類似的分化潛能。而測得ENSCs和CNS-NSCs的Ret陽性細(xì)胞比例分別為 1.4％ 和 7.0％（P＜0.05），提示在Ret表達(dá)方面兩者存在差異。 ⑥NADPH-d酶組織化學(xué)顯示腸

7、神經(jīng)球內(nèi)有大量NO陽性的氮能神經(jīng)元，而腦神經(jīng)球則含量不多；流式細(xì)胞儀測得ENSCs和CNS-NSCs的AchE陽性細(xì)胞比例分別為16.6％和2.3％（P＜0.05），差異有顯著性。 ⑦PKH-26標(biāo)記后，可見標(biāo)記的ENSCs紅色熒光顯示佳，形態(tài)與標(biāo)記前無區(qū)別，細(xì)胞折光性良好。⑧ENSCs移植術(shù)后3、7、14天，結(jié)腸和幽門壁均可觀察到移植的紅色熒光細(xì)胞，并保持正常細(xì)胞形態(tài)；隨著移植時間延長，移植細(xì)胞的分布從不規(guī)則轉(zhuǎn)為規(guī)則性，有朝四

8、周擴(kuò)展的跡象；移植術(shù)后14天，通過Hoechst33258核染和Tuj-1免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡觀察和圖像重建，顯示移植細(xì)胞形態(tài)完整，并表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Tuj-1。 結(jié)論： ①本實(shí)驗(yàn)通過分離培養(yǎng)方法，能夠從胎大鼠腸道提取出能反復(fù)傳代、具有不斷增殖和多向分化潛能的ENSCs，并在國內(nèi)先期進(jìn)行了報告，同時提出了腸神經(jīng)干細(xì)胞概念或定義。 ②通過免疫熒光流式細(xì)胞技術(shù)較準(zhǔn)確地測定了ENSCs原代培養(yǎng)前后的含量

9、，對今后評價干細(xì)胞生物學(xué)特性、進(jìn)行各種途徑的干預(yù)研究提供了一個較可靠的量化指標(biāo)。 ③ENSCs有不同于CNS-NSCs的增殖、分化特性，存在著Ret表達(dá)差異，但部分分化特性有其相似性。ENSCs的nNOS與AchE的表達(dá)明顯高于CNS-NSCs，可能有利于作為這兩類神經(jīng)元發(fā)育異常性疾病的移植細(xì)胞源。 ④ENSCs移植到消化道后能夠存活，并顯示遷移、分化的跡象，提示ENSCs可作為腸神經(jīng)元異常性疾病進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的