SDF-1α修飾神經(jīng)嵴干細(xì)胞治療脊髓損傷.pdf

1、目的：探討以AAV為載體，SDF-1α修飾NCSCs移植脊髓損傷部位，通過SDF-1α對于細(xì)胞的趨化和增值作用，誘導(dǎo)自體及移植干細(xì)胞向損傷部位遷徙、分化、增值，提高軸突及髓鞘再生、重建神經(jīng)環(huán)路、促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。 方法：骨髓基質(zhì)細(xì)胞取自股骨骨干，梯度離心提純培養(yǎng)，TRIzol抽提細(xì)胞裂解液總mRNA，RT-PCR擴(kuò)增SDF-1α片段插入pcDNA3.1-V5-HIS構(gòu)建pcDNA3.1-SDF-1α-V5-HIS。測序排除P

2、CR突變后，亞克隆SDF-1α到pAAV構(gòu)建pAAV-SDF-1α-V5，Sca I酶切驗(yàn)證。原病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，培養(yǎng)72小時裂解后氯化銫梯度超速離心，取折射率1.365至1.380的病毒懸液，HN緩沖液透析，實(shí)時定量PCR檢測病毒效價，Western blot驗(yàn)證病毒載體生物活性。 取孕14.5天胎鼠海馬細(xì)胞，胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，以10<'4>/ml密度接種在無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，

3、每3天換半液，Nestin染色驗(yàn)證后，更換全培養(yǎng)液培養(yǎng)，MAP2、GFAP及GC驗(yàn)證其向神經(jīng)元、星形細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化能力。取孕14.5-E17胎鼠坐骨神經(jīng)，胰蛋白酶及膠原酶消化，F(xiàn)ACS分離提取p75<'+>PO<'->細(xì)胞在多聚賴氨酸和纖連蛋白處理的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每3天換半液。更換全培養(yǎng)液培養(yǎng)，S100、SMA及Peripheri n驗(yàn)證其向雪旺氏細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞、神經(jīng)元等的多向分化能力。Boyden趨化小室驗(yàn)證SDF-1

4、α對神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的趨化作用，MTT法驗(yàn)證SDF-1α對神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的增殖作用 24只脊髓重力損傷大鼠模型平均分為4組，即偽手術(shù)組(Sham)、生理鹽水組(NS)、神經(jīng)嵴干細(xì)胞組(NCSC)及NCSC-SDF-1α組，損傷處微量注射5 μ 1治療液，細(xì)胞組每支注射10<'5>個細(xì)胞。BBB評分及斜板實(shí)驗(yàn)觀測實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓功能恢復(fù)情況，BDA順行示蹤觀測軸突再生。4周后處死動物，取損傷節(jié)段脊髓行免疫組化、免疫熒光及電

5、鏡檢查。 結(jié)果： ScaI消化pAAV—SDF一1α后出現(xiàn)三條段帶，Western印跡顯示AAV—SDF一1α感染裂解液僅出現(xiàn)12KD條帶，與理論之相符。 孕14.5天胎鼠海馬組織培養(yǎng)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)后形成的細(xì)胞球?yàn)镹estin陽性，能夠耐受多次體外傳代。貼壁培養(yǎng)可以分化神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞。孕14.5-17天胎鼠坐骨神經(jīng)p75+PO一細(xì)胞培養(yǎng)后形成似小纖維母細(xì)胞的類似細(xì)胞，多角形，細(xì)胞核較大，邊緣反光強(qiáng)，含1到3個

6、突起，可分化為雪旺氏細(xì)胞，肌纖維母細(xì)胞及神經(jīng)元，雪旺氏細(xì)胞比例隨胎鼠日齡增大而增高。 Boyden chamber趨化小室顯示隨SDF一1α濃度增高，遷徙到下層小室的細(xì)胞數(shù)增高(P<0.01)。MTT實(shí)驗(yàn)示隨SDF—lα濃度增高，培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)。遷徙實(shí)驗(yàn)顯示SDF一1α組神經(jīng)球平均遷徙帶為11.32條，大于對照組7.36條(P<0.01)；總遷徙距離為3.65mm，大于對照組213mm(P<0.01)。BB

7、B評分及斜板實(shí)驗(yàn)中均顯示除偽手術(shù)組外，NCSC—SDF一1α組得分最高，NS組最低，差異具有顯著性。組織學(xué)檢查顯示移植細(xì)胞存活,SDF一1α 表達(dá)，除偽手術(shù)組外，脊髓可見不同程度的壞死，NCSC和NCSC—SDF—lα組脊髓壞死范圍較對照組小。NCSC—SDF一1α組軸突脫髓鞘改變明顯較NS減輕。BDA示蹤顯業(yè)NCSC—SDF一1α組較多示蹤劑通過損傷部位，NS組少見。 結(jié)論：孕14.5胎鼠坐骨神經(jīng)p75<'+>P0<'->細(xì)胞