力學(xué)刺激調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、神經(jīng)嵴干細(xì)胞(Neural crest stem cells，NCSCs)是一種多潛能神經(jīng)干細(xì)胞，具有分化為多種細(xì)胞類型的能力，包括血管平滑肌細(xì)胞(Smooth muscle cells，SMCs)、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、施旺細(xì)胞和神經(jīng)元等。因此，NCSCs被認(rèn)為是構(gòu)建組織工程化血管支架潛在的種子細(xì)胞來源。然而，血管微環(huán)境，尤其血管壁受到的力學(xué)刺激，如何影響NCSCs的分子機(jī)理，至今尚未所知。
　　 天然血管在機(jī)體內(nèi)一直

2、受到體內(nèi)搏動性動脈血流所產(chǎn)生的力學(xué)刺激，即血流脈沖對血管壁施加的周期性單軸拉伸應(yīng)力，它在NCSCs分化成血管SMCs的過程中起著重要的作用。為模擬血管壁上SMCs沿圓周方向排列分布，我們引入軟光刻技術(shù)(Soft lithography)制備表面具有平行排列微溝的彈性硅膠膜，這種微排列可使NCSCs和受力方向平行，同時選用來源于人體胚胎干細(xì)胞(Embryonic stemcells，ESCs)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluri

3、potent stem cells，iPSCs)的NCSCs作為模式細(xì)胞，通過自制的機(jī)械拉伸裝置對細(xì)胞施加5％、1Hz的周期性單軸拉伸的牽引力，考察NCSCs對機(jī)械拉伸的各向異性響應(yīng)；在此基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)因子，深入探討平行于微溝方向的機(jī)械拉伸調(diào)節(jié)NCSCs向SMCs分化的研究。
　　 本研究設(shè)定三個實驗組：在光滑彈性膜上受力的稱為平板組(Unpatterned)，受力方向與微溝平行的稱為平行組(Parallel-patterne

4、d)、受力方向與微溝垂直的稱為垂直組(Perpendicular-patterned)，我們分別從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、分子水平和蛋白水平等方面進(jìn)行檢測。主要研究工作和結(jié)果如下：
　　 1.NCSCs對機(jī)械拉伸的各向異性響應(yīng)初探：
　　 NCSCs具有多潛能性，且在發(fā)育和組織再生過程中起著極其重要的作用。然而，NCSCs對力學(xué)刺激的各向異性響應(yīng)仍不清楚。為了研究這一各向異性力學(xué)響應(yīng)，我們將NCSCs培養(yǎng)在表面具有平行排列微

5、溝的彈性膜上，然后對其施加5％、1Hz的周期性單軸拉伸1-2天，受力方向與微溝平行/垂直。共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，三個實驗組中，平板組的細(xì)胞垂直于受力方向排列，平行組和垂直組的細(xì)胞沿著微溝方向有序排列；細(xì)胞與細(xì)胞核的形態(tài)隨之做出相應(yīng)的變化；機(jī)械拉伸使平行組的細(xì)胞增殖率和組蛋白去乙?；?HDAC)活性顯著增加；機(jī)械拉伸使平板組與平行組這兩組的收縮性標(biāo)記蛋白Calponin1(CNN1)表達(dá)明顯上調(diào)，同時使平行組的SMCs中期標(biāo)記Smoot

6、helin(SMTN)表達(dá)增強(qiáng)，但不引起其它標(biāo)記的變化。這些結(jié)果顯示，NCSCs對各向異性的力學(xué)微環(huán)境有著不同的響應(yīng)，且平行組即受力方向與微溝平行的NCSCs更好地模擬血管微環(huán)境，且具有向SMCs分化的趨勢。
　　 2.平行于受力方向的機(jī)械拉伸調(diào)節(jié)NCSCs向SMCs分化的研究：
　　 為了探討血管內(nèi)的力學(xué)因素是否對NCSCs向SMCs分化起到調(diào)節(jié)作用，我們特別關(guān)注平行組的機(jī)械拉伸，即細(xì)胞受力方向與微溝平行，以模擬血管S

7、MCs圓周方向的排列與受力。結(jié)果顯示，首先，平行于微溝方向的機(jī)械拉伸改變了細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)了NCSCs的增殖能力和ERK2的磷酸化；此外，短期的機(jī)械拉伸誘導(dǎo)了收縮性標(biāo)記蛋白CNN1和SMCs中期標(biāo)記SMTN增加，機(jī)械拉伸長期作用使SMCs后期標(biāo)記Myosin heavy chain(MHC)輕微增強(qiáng)。同時，該機(jī)械拉伸抑制了其他分化標(biāo)記的表達(dá)，說明平行于微溝方向的機(jī)械拉伸促使NCSCs向SMCs分化。在拉伸過程中，神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基會抑制CNN