RET-CXCR4通路介導(dǎo)神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞遷移及其在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生中的作用.pdf

1、第一部分、RET、CXCR4在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織不同腸段中的表達(dá)特點(diǎn)及意義
　　目的:研究RET、CXCR4在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者痙攣段、擴(kuò)張段、正常段（吻合口部位）中的表達(dá)模式和分布特點(diǎn)，并與正常結(jié)腸組織的表達(dá)和分布進(jìn)行比較，初步探討RET和CXCR4在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生及臨床分子診斷中的作用。
　　方法:收集先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織61例，正常結(jié)腸組織6例;qPCR檢測RET、CX

2、CR4 mRNA在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織不同腸段的表達(dá)水平;Western blot檢測RET、CXCR4蛋白在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織不同腸段的表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)、免疫熒光檢測RET、CXCR4蛋白在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織不同腸段和正常結(jié)腸組織的表達(dá)分布和定位。
　　結(jié)果:
　　1）先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥結(jié)腸組織痙攣段RET、CXCR4mRNA表達(dá)水平較正常段和擴(kuò)張段顯著降低(P＜0.

3、01，n=57)，正常段與擴(kuò)張段組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，n=57);
　　2)先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥結(jié)腸組織痙攣段RET蛋白和CXCR4蛋白表達(dá)水平較正常段和擴(kuò)張段顯著降低(P＜0.01，n=57);
　　3)在正常結(jié)腸和先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織正常段和擴(kuò)張段，RET和CXCR4蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，CXCR4除了表達(dá)于神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞外，神經(jīng)節(jié)內(nèi)的施旺細(xì)胞也有表達(dá)。痙攣段未見神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)

4、節(jié)發(fā)育異常，RET和CXCR4蛋白表達(dá)明顯減少;
　　4）免疫熒光雙標(biāo)顯示，在有神經(jīng)節(jié)存在的正常結(jié)腸組織和先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者結(jié)腸組織正常段、擴(kuò)張段，CXCR4主要表達(dá)于整個(gè)神經(jīng)節(jié)部位，而RET主要表達(dá)于零散分布于神經(jīng)節(jié)部位的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，RET、CXCR4共表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏的痙攣段，未檢測到顯著的RET和CXCR4共表達(dá)。
　　結(jié)論:RET、CXCR4表達(dá)于人體結(jié)腸組織神經(jīng)節(jié)部位的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，兩者在先

5、天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者痙攣段表達(dá)水平顯著低于正常段。RET、CXCR4在正常結(jié)腸和先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患者不同腸段的表達(dá)模式和分布的差異，提示其可以作為HSCR的一個(gè)臨床分子診斷指標(biāo)用于臨床診斷。
　　第二部分、構(gòu)建表達(dá)RET基因RNA干擾片段的重組腺病毒
　　目的:構(gòu)建表達(dá)RET基因RNA干擾片段的重組腺病毒，通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)下調(diào)RET基因表達(dá)，并驗(yàn)證重組腺病毒對RET基

6、因的沉默效率。
　　方法:采用DNA重組技術(shù)將靶向RET基因的RNA干擾片段定向克隆于腺病毒穿梭質(zhì)粒pSES-HUS，再通過同源重組的方法，將其與5型腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy共轉(zhuǎn)染于BJ5183細(xì)菌獲得可表達(dá)RET基因siRNA的重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝獲得高滴度腺病毒，最后將重組腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y，通過RT-PCR、Western-blot方法驗(yàn)證其對RET基因沉默的效果。

7、r>　　結(jié)果:
　　1）成功構(gòu)建表達(dá)RET基因RNA干擾片段的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pSES-siRET-site1、2、3以及陰性對照質(zhì)粒pSES-siRET-scrambled;
　　2)通過同源重組方法成功制備重組腺病毒質(zhì)粒pAd5-siRET-sitel、2、3，并包裝收獲高滴度腺病毒Ad5-simRET;
　　3）RT-PCR、Western blot均證實(shí)收獲的腺病毒Ad5-simRET能夠有效抑制RET的表達(dá)

8、。
　　結(jié)論:成功制備表達(dá)RET基因RNA干擾片段的重組腺病毒Ad5-simRET，并證實(shí)腺病毒Ad5-simRET能夠有效抑制RET的表達(dá)，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分、RET/CXCR4通路對神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞遷移等生物學(xué)行為調(diào)控的作用及機(jī)制
　　目的:通過重組腺病毒Ad5-simRET轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的迷走神經(jīng)嵴干細(xì)胞(VNCSCs)和神經(jīng)嵴來源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y下調(diào)RET表達(dá)，研究RET表達(dá)下調(diào)

9、對CXCR4表達(dá)的影響，以及抑制RET/CXCR4通路對神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞遷移等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:原代培養(yǎng)并鑒定小鼠迷走神經(jīng)嵴干細(xì)胞，并將重組腺病毒Ad5-simRET轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的迷走神經(jīng)嵴干細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y下調(diào)RET表達(dá);qPCR、Western blot檢測RET表達(dá)下調(diào)后CXCR4、Etv4/5 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化;MTT分析RET表達(dá)下調(diào)對VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

10、;流式細(xì)胞術(shù)分析RET表達(dá)下調(diào)對VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響;Transwell、MatrigelBiocoat Invasion Chambers Insert系統(tǒng)分析RET表達(dá)下調(diào)對VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1）成功原代培養(yǎng)VNCSCs，并鑒定其干細(xì)胞特性和多向分化能力;
　　2）重組腺病毒Ad5-simRET能夠高效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的迷走神經(jīng)嵴干細(xì)胞和神經(jīng)母

11、細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y，并能有效抑制RET的表達(dá);
　　3）通過qPCR、Western blot證實(shí)RET下調(diào)可抑制CXCR4、Etv4/5mRNA和蛋白表達(dá);
　　4）與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染Ad5-simRET后，VNCSCs和SH-SY5Y的增殖明顯受到抑制，但對其凋亡無明顯影響;
　　5）轉(zhuǎn)染Ad5-simRET后，VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞遷移能力較空白對照組和陰性對照組均明顯受到抑制，

12、CXCR4抑制劑AMD3100也能有效抑制VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞向SDF-1的趨化能力;
　　6）VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad5-simRET后，細(xì)胞侵襲能力較空白對照組和陰性對照組均明顯降低。
　　結(jié)論:下調(diào)VNCSCs和SH-SY5Y細(xì)胞RET基因的表達(dá)能夠抑制CXCR4、Etv4/5等分子的表達(dá)，抑制RET/CXCR4通路能夠抑制神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。
　　第四部分、Ret/

13、Cxcr4通路介導(dǎo)神經(jīng)嵴干細(xì)胞遷移在小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用
　　目的:研究小鼠胚胎發(fā)育不同時(shí)期(E11.5～PN10) Ret、Cxcr4在腸道組織的表達(dá)水平的變化特點(diǎn)和表達(dá)定位情況，通過尾靜脈注射RET基因RNA干擾質(zhì)粒下調(diào)RET基因表達(dá)，探討Ret/Cxcr4通路介導(dǎo)神經(jīng)嵴干細(xì)胞遷移在小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用。
　　方法:通過qPCR、Western blot檢測Ret、Cxcr4 mRNA和蛋白在不同發(fā)育時(shí)期的小

14、鼠胚胎腸道組織中的表達(dá)水平，免疫熒光檢測Ret、Cxcr4蛋白在發(fā)育中的小鼠胚胎腸道組織中的表達(dá)的定位情況;通過尾靜脈注射Ret基因RNA干擾質(zhì)粒下調(diào)Ret基因表達(dá);P75/Ret免疫熒光染色標(biāo)記腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)不同腸段腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞的數(shù)量，分析抑制Ret/Cxcr4通路對小鼠腸道神經(jīng)嵴干細(xì)胞在腸道遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　1）qPCR結(jié)果顯示，在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期，也就是腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞在腸道遷移、增殖、定植的關(guān)

15、鍵時(shí)期(E11.5—E15.5)，腸道組織Ret、Cxcr4 mRNA表達(dá)水平顯著性地高于腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育后期，表達(dá)水平隨腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育呈逐漸下降趨勢;
　　2)Western blot結(jié)果提示，不同發(fā)育階段Ret和Cxcr4蛋白表達(dá)模式與mRNA表達(dá)水平的變化基本一致;
　　3）孕鼠尾靜脈注射Ret基因RNA干擾質(zhì)粒跨過胎盤組織后，能夠有效下調(diào)胚胎腸道組織Ret的表達(dá);
　　4）P75/Ret免疫熒光標(biāo)記的神經(jīng)嵴干細(xì)胞