膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸中的表達(dá)和分布研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景及目的：
　　GDNF基因編碼膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF），它的編碼產(chǎn)物GDNF參與細(xì)胞生長分化、增殖和凋亡有關(guān)的信號傳導(dǎo)。近年研究表明，GDNF與眾多疾病關(guān)系密切，其異常表達(dá)不僅導(dǎo)致某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而且也是眾多腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要機(jī)制之一[1,2,3]。
　　Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of C

2、ajal，ICC)廣泛分布于消化道，是胃腸慢波活動的起搏細(xì)胞及其基本電節(jié)律的主要傳播細(xì)胞[4]，并參與胃腸道神經(jīng)信息的傳遞[5]。有關(guān)ICC的胚胎起源爭論較多，多認(rèn)為起源于間充質(zhì)細(xì)胞，近年研究表明，ICC與眾多胃腸道疾病關(guān)系密切，其分布異常、數(shù)目減少可能是這些疾病發(fā)病的重要病理生理機(jī)制之一。
　　先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung's disease，HD）是一種腸神經(jīng)系統(tǒng)先天性異常疾病，其具體致病因素及發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡

3、明。一般認(rèn)為與遺傳、腸壁內(nèi)環(huán)境改變、免疫及感染等因素有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，HD患兒有多種基因突變，其基因的編碼產(chǎn)物在腸道表達(dá)異常。ICC作為胃腸道基本電活動的起搏細(xì)胞，對其形態(tài)、生理功能已有較多的研究，在HD，一些基因編碼產(chǎn)物（神經(jīng)營養(yǎng)因子）表達(dá)異常，ICC在腸壁分布異常，HD成為深入研究ICC和某些因子關(guān)系的良好模型。但迄今為止，國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見有關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子和ICC比較的研究。
　　本實(shí)驗(yàn)通過收集HD的標(biāo)本，全部取材經(jīng)組織病理

4、學(xué)檢測符合HD診斷。應(yīng)用半定量RT-PCR及免疫組化技術(shù)檢測HD患兒結(jié)腸手術(shù)標(biāo)本組織中GDNFmRNA表達(dá)水平和ICC的分布，分析并統(tǒng)計(jì)其在不同腸段的表達(dá)及其兩者間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究HD的發(fā)病機(jī)制和深入研究ICC提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　試驗(yàn)方法：
　　收集42例經(jīng)病理診斷為先天性巨結(jié)腸的標(biāo)本，其中男33例，女9例，年齡2月-10歲，全部實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均為散發(fā)病例，取材經(jīng)組織病理學(xué)檢測符合HD診斷，5例腸套疊患兒（術(shù)前取得家屬同

5、意）結(jié)腸手術(shù)標(biāo)本作為正常對照。分別收集HD患兒手術(shù)切除腸管狹窄段、移行段和擴(kuò)張段全層標(biāo)本，一部分液氮保存，對應(yīng)部分多聚甲醛固定保存。
　　第一部分：GDNFmRNA在HD不同腸段的表達(dá)研究。應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測42例HD患兒手術(shù)標(biāo)本狹窄段、移行段和擴(kuò)張段組織中GDNFmRNA水平，及5例腸套疊患兒結(jié)腸手術(shù)標(biāo)本組織中GDNFmRNA水平，分析并統(tǒng)計(jì)其與臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。
　　第二部分：ICC在HD不同腸段的分布

6、觀察。分別取42例HD患兒不同腸段組織標(biāo)本，多聚甲醛固定、脫水、包埋，常規(guī)超薄切片，采用特異性酪氨酸激酶受體（c-kit）抗體免疫組織化學(xué)法觀察ICC分布。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.5例正常對照腸管GDNFmRNA均表達(dá)陽性(100％)；42例新鮮標(biāo)本，狹窄段11例GDNFmRNA表達(dá)陽性（26.2％）；移行段15例GDNFmRNA表達(dá)陽性（35.7％）；擴(kuò)張段40例GDNFmRNA表達(dá)陽性（95.2％）。與擴(kuò)張段和正常對照

7、結(jié)腸相比，狹窄段結(jié)腸組織中GDNFmRNA水平明顯降低，差異具有顯著性（P〈0.05）；擴(kuò)張段結(jié)腸和正常對照GDNFmRNA水平相當(dāng)，差異無顯著性（P>0.05）。
　　2.免疫組化觀察結(jié)果：（1）正常對照組結(jié)腸組織中ICC主要分布于粘膜下叢（IC-SM）和肌間叢（IC-MY），IC-MY在切面上幾乎呈現(xiàn)連續(xù)性分布，相互連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。（2）在HD患兒結(jié)腸，①狹窄段組結(jié)腸組織內(nèi)ICC的分布較正常對照組和擴(kuò)張段組顯著減少（P＜0

8、.001)，IC-MY的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)完全破壞，殘存ICC形態(tài)也出現(xiàn)異常；②移行段組結(jié)腸組織內(nèi)ICC的分布較正常對照組和擴(kuò)張段組減少（P＜0.05)，但較狹窄段組顯著增加（P＜0.001），其形態(tài)部分接近正常，但I(xiàn)C-MY缺乏連續(xù)性分布，未能形成正常的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；③擴(kuò)張段組與正常對照組結(jié)腸組織內(nèi)ICC分布相當(dāng)，差異無顯著性（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.HD患兒結(jié)腸不同腸段GDNFmRNA表達(dá)有差異。GDNFmRNA在狹

9、窄段表達(dá)量較擴(kuò)張段和正常對照腸段明顯減少，甚至無表達(dá)；在擴(kuò)張段和正常對照腸段的表達(dá)無明顯差異；在移行段的表達(dá)量與狹窄段和擴(kuò)張段比較均有差異。
　　2.HD患兒結(jié)腸不同腸段ICC的數(shù)量、形態(tài)、分布不同。在狹窄段肌間叢偶見殘存的ICC，其形態(tài)變鈍、突起減少或者消失；在擴(kuò)張段和正常對照腸段粘膜下叢和肌間叢均可見連續(xù)分布的ICC，呈梭形有２-３個(gè)突起；在移行段ICC主要分布于肌間叢，數(shù)量居于狹窄段和擴(kuò)張段之間。
　　3.HD患兒結(jié)腸