大鼠神經(jīng)上皮干細胞移植治療無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的實驗研究.pdf

1、本文設計了該項研究課題，即在無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的大鼠模型上，探討神經(jīng)上皮干細胞移植治療無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的可行性，為該病的治療開辟一條新路。實驗分三部分進行： 第一部分神經(jīng)上皮干細胞的分離培養(yǎng)和體外標記神經(jīng)上皮干細胞的分離培養(yǎng)和體外標記是進行干細胞移植的前提條件。經(jīng)多次試驗，我們成功地摸索出了一個分離培養(yǎng)、體外標記神經(jīng)上皮干細胞的最佳方案。從孕11.5天的Wistar大鼠胚胎中分離神經(jīng)管，機械吹打后獲得單細胞懸液，接種于

2、無血清培養(yǎng)基DMEM/F12(含B27)，并加入堿性成纖維細胞生長因子靜置培養(yǎng)。72小時后開始出現(xiàn)許多十幾個細胞聚集形成的細胞團，呈懸浮狀態(tài)，即神經(jīng)球。第6天每個細胞集落由幾十甚至幾百個細胞聚集形成，Nestin染色呈強陽性。將神經(jīng)球置于含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)7天后進行微管相關蛋白2和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白免疫細胞化學染色，染色結果顯示，神經(jīng)上皮干細胞能分化為MAP2陽性的神經(jīng)細胞及GFAP陽性的膠質(zhì)細胞。通

3、過進一步的RT-PCR檢測，顯示培養(yǎng)的神經(jīng)上皮干細胞在體外表達腸神經(jīng)營養(yǎng)因子受體系統(tǒng)rearranged during transformation(RET)receptor tyrosine kinase和GFRα1，說明這種細胞可接受腸壁環(huán)境中的生長因子信號的調(diào)控，更有利于移植后向腸神經(jīng)細胞方向分化。為了移植后可以在體內(nèi)示蹤，我們在體外對細胞進行了5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷標記，于移植前3d在細胞中摻入BrdU，經(jīng)BrdU免疫細胞化

4、學染色，神經(jīng)球中有大約90％的細胞呈BrdU陽性，為下一步的移植實驗提供了良好的示蹤標記細胞的方法。 第二部分無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病動物模型的建立建立無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的動物模型是進行細胞移植治療實驗研究的基本條件。為此，我們根據(jù)無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的病理變化，以大鼠為實驗動物，選用陽離子表面活性劑-芐基-二甲基-十四烷基氯化銨作為神經(jīng)細胞的選擇性滅活劑，作用于大鼠的遠段結腸漿膜表面，選擇性的滅活腸神經(jīng)節(jié)細胞，成功地建立了

5、該病的動物模型。術后4周大體解剖發(fā)現(xiàn)，BAC作用處腸管痙攣狹窄，其上方腸管擴張、腸內(nèi)容物潴留；結腸測壓球囊擴張刺激反射實驗顯示無神經(jīng)節(jié)細胞段結腸的反射性收縮消失；HE染色、免疫熒光染色及組織化學染色證實，BAC作用處肌間和粘膜下神經(jīng)節(jié)細胞消失，乙酰膽堿酯酶的活性明顯減低；Western blot也證實神經(jīng)型一氧化氮合酶和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達明顯降低。證明了該動物模型與人類的無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病類似，為進一步研究該病的發(fā)病機理和治療方法

6、提供了適宜的動物模型。 第三部分無神經(jīng)節(jié)細胞腸壁內(nèi)神經(jīng)上皮干細胞的移植和移植后的檢測在成功建立動物模型的基礎上，我們進行了神經(jīng)上皮干細胞的移植。取BrdU標記的第5代的神經(jīng)上皮干細胞，移植到模型鼠去除腸神經(jīng)節(jié)細胞的腸段。移植4周時檢測發(fā)現(xiàn)，移植細胞存活良好，并部分分化為蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gerle product 9.5，PGP9.5)陽性的神經(jīng)細胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞。移植8周后移植細胞分化成為nNO

7、S及ChAT陽性的神經(jīng)細胞。結腸測壓球囊擴張刺激反射實驗顯示細胞移植后腸神經(jīng)反射性收縮恢復，腸離體肌條試驗結果也表明神經(jīng)上皮干細胞移植組結腸較未移植細胞的模型組結腸有明顯的EFS誘導的舒張或收縮反應。這提示神經(jīng)上皮干細胞在腸壁的微環(huán)境中可以存活，并分化為功能性的腸神經(jīng)細胞，而且可恢復無神經(jīng)節(jié)細胞結腸段的神經(jīng)運動功能。結論本項研究成功地分離培養(yǎng)、鑒定和標記了神經(jīng)上皮干細胞，成功地建立了無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的大鼠模型，并成功地進行了腸壁內(nèi)

8、干細胞移植，通過移植后的檢測，證明了移植細胞在腸壁中能夠分化成功能性的腸神經(jīng)細胞，并能恢復腸神經(jīng)運動功能。這表明神經(jīng)干細胞腸壁內(nèi)移植有望成為治療無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的新方法。 目的：將神經(jīng)上皮干細胞(neuroepithelial stem cells，NESCs)移植到模型鼠無神經(jīng)節(jié)細胞的腸壁內(nèi)，觀察NESCs存活分化及對腸神經(jīng)運動功能改善的情況。 方法：從孕11.5天大鼠胚胎神經(jīng)管中分離、培養(yǎng)NESCs，用5-溴-

9、2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標記細胞。用化學試劑芐基-二甲基-十四烷基氯化銨(benzalkonium chloride，BAC)選擇性去除大鼠一段結腸壁內(nèi)的神經(jīng)節(jié)細胞建立無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的動物模型，4周后將標記的NESCs注入無神經(jīng)節(jié)細胞的腸壁內(nèi)。分別于移植后的2周、4周和8周處死大鼠，通過免疫熒光雙染觀察移植細胞的存活、分化情況，并進行結腸測壓球囊擴張刺激反射實驗和腸壁離體肌條的

10、電場刺激(electrical field stimulation，EFS)實驗來觀察移植后神經(jīng)調(diào)節(jié)的腸運動功能的恢復情況。 結果：NESCs移植后2周可見移植細胞在體內(nèi)存活良好呈未分化狀態(tài)，4周可檢測到移植細胞分化為PGP9.5陽性的成熟神經(jīng)細胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞，8周可檢測到移植細胞分化成神經(jīng)性一氧化氮合酶(nNOS)及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性的有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的腸神經(jīng)細胞。移植后8周測壓結果顯示模型組結腸對

11、球囊擴張刺激的神經(jīng)反射消失，而細胞移植組結腸的神經(jīng)反射功能明顯恢復；腸離體肌條生理實驗結果顯示模型組結腸對EFS無反應，而EFS可引起細胞移植組結腸舒張或收縮反應，表明NESCs移植后結腸的腸神經(jīng)運動功能有明顯的恢復。 結論：NESCs在無神經(jīng)節(jié)腸壁內(nèi)可以存活和分化，并能恢復腸神經(jīng)運動功能，因此移植NESCs為無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病開辟了細胞移植治療的新途徑。 目的：用化學方法選擇性去除大鼠腸神經(jīng)節(jié)細胞，建立類似于人類無

12、神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的大鼠模型。 方法：體重為200g左右的Wistar大鼠60只，隨機分為兩組：(1)模型組(30只)，(2)對照組(30只)。模型組通過開腹手術將0.5％的芐基-二甲基-十四烷基氯化銨(benzalkonium chloride，BAC)作用于大鼠降結腸遠端2cm長的腸管漿膜表面30分鐘，用生理鹽水作對照組。術后4周，觀察作用部位的大體解剖變化，并進行結腸測壓球囊擴張刺激反射實驗檢測腸神經(jīng)反射功能。取處理段結

13、腸行病理學檢查，通過冰凍切片的HE染色、PGP9.5免疫熒光染色和乙酰膽堿酯酶(AchE)組織化學染色觀察局部腸神經(jīng)節(jié)細胞及神經(jīng)纖維的消除情況。同時通過Western blot檢測神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)這兩種腸神經(jīng)遞質(zhì)合成酶的表達情況。 結果：術后4周的大體解剖發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠BAC作用處的腸管痙攣狹窄，其上方腸管擴張、腸內(nèi)容物潴留；處理段結腸對近端結腸擴張刺激的反射性收縮消失；組織學檢查證實

14、，BAC作用處肌間和粘膜下神經(jīng)節(jié)細胞消失，AchE的活性明顯減低；Western blot也證實nNOS和ChAT的表達明顯降低。 結論：用BAC選擇性去除腸神經(jīng)的方法成功地建立了無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結腸病的大鼠模型，為進一步研究該病的發(fā)病機理、病理生理改變和治療方法提供了適宜的動物模型。 目的：從胚胎大鼠神經(jīng)管中分離出神經(jīng)上皮干細胞進行培養(yǎng)擴增，觀察其在體外的表型及分化特性，并進行體外標記示蹤，為進一步的移植研究提供細胞基

15、礎。 方法：采用顯微解剖、機械吹打、無血清懸浮培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)神經(jīng)上皮干細胞，通過免疫細胞化學染色及RT-PCR技術，檢測神經(jīng)上皮干細胞巢蛋白(Nestin)、腸神經(jīng)營養(yǎng)因子受體系統(tǒng)rearranged during transformation(RET)receptor tyrosine kinase、GFRα1(GDNF family receptorα1)以及分化后神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標志抗原MAP2(microt

16、ubule associated protein2)、GFAP(glial fibrillary acidic protein)的表達。采用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標記神經(jīng)上皮干細胞，觀察標記率及標記的穩(wěn)定性。 結果：無血清培養(yǎng)72小時后出現(xiàn)許多十幾個細胞聚集形成的細胞團，邊界清楚，折光性強，呈懸浮狀態(tài)，即神經(jīng)球。第6天每個細胞集落由幾十甚至幾百個細胞聚集形成。原代和傳

17、代培養(yǎng)的神經(jīng)球呈Nestin抗原陽性，RT-PCR結果顯示神經(jīng)球來源的mRNA呈RET及GFRα1陽性。經(jīng)傳代有血清培養(yǎng)后神經(jīng)球中的細胞分化為MAP2陽性的神經(jīng)細胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)標記后的神經(jīng)球中約90％的細胞呈BrdU陽性，神經(jīng)球分化后形成的神經(jīng)細胞也呈BrdU陽性。 結論：分離自胎鼠神經(jīng)管的神經(jīng)上皮干細胞是增殖能力很強的神經(jīng)干細胞，并具有分化為神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞的潛能；能表達腸營養(yǎng)因子受體系統(tǒng)，