SLP-2在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化中的作用研究.pdf

1、目的：子宮內(nèi)膜的增殖和蛻膜化對(duì)于建立和維持正常的妊娠至關(guān)重要。蛻膜化被一系列源于胚胎和母體的調(diào)節(jié)器所控制。然而，蛻膜化的潛在分子機(jī)制尚不完全明確。本課題組前期基因表達(dá)分析和RNA測(cè)序結(jié)果均顯示 SLP-2在圍植入期子宮內(nèi)膜存在差異性表達(dá)，其在著床點(diǎn)的表達(dá)顯著高于著床旁。研究表明，癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá) SLP-2會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞黏附和腫瘤發(fā)展，但是 SLP-2在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化中的功能仍不清楚。所以，我們提出假設(shè)：SLP-2參與

2、圍植入期子宮內(nèi)膜功能的演變--基質(zhì)細(xì)胞增殖和蛻膜化。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型建立及標(biāo)本收集：購(gòu)買(mǎi)8周齡昆明小鼠飼養(yǎng)
　　正常妊娠模型：將正常性成熟雌鼠與雄鼠合籠交配，次日見(jiàn)陰栓標(biāo)記為孕1天（D1）。小鼠正常妊娠1、4、5、6、8天脫頸處死，收集子宮組織。
　　假孕模型：將正常性成熟雌鼠與結(jié)扎了輸精管的雄鼠合籠交配，次日見(jiàn)陰栓標(biāo)記為假孕1天（PD1）。小鼠假孕1、4、5、6、8天脫頸處死，收集子宮。
　

3、　人工誘導(dǎo)蛻膜化模型：小鼠假孕4天（PD4）一側(cè)宮角注射玉米油誘導(dǎo)蛻膜化，對(duì)照側(cè)宮角不作處理作為對(duì)照，假孕8天（PD8）處死，收集子宮組織。
　　2.圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中slp-2基因表達(dá)模式
　　1）小鼠眞正常妊娠模型中 slp-2基因表達(dá)模式：對(duì)小鼠正常妊娠 D1、D4、D5、D6、D8子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行熒光定量 PCR、免疫印跡法和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察slp-2在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)規(guī)律。
　　2）小鼠假孕模型中s

4、lp-2基因表達(dá)模式：對(duì)小鼠假孕模型PD1、PD4、PD5、PD6、PD8子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行熒光定量PCR、免疫印跡法和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察slp-2在假孕小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)模式。
　　3）小鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中 slp基因表達(dá)檢測(cè)：熒光定量PCR檢測(cè)小鼠蛻膜化標(biāo)志基因dtprp的表達(dá)確定人工誘導(dǎo)蛻膜化模型是否建立成功；采用熒光定量PCR、免疫印跡法和免疫組化檢測(cè)觀察slp-2的表達(dá)。
　　3.人不同月經(jīng)周期/蛻膜組織中

5、SLP-2基因的表達(dá)：對(duì)人子宮內(nèi)膜增生期、分泌期和蛻膜組織進(jìn)行熒光定量 PCR、免疫印跡法和免疫組織進(jìn)行檢測(cè)觀察SLP-2的表達(dá)。
　　4.原代培養(yǎng)小鼠和人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞：利用小鼠假孕4天（PD4）子宮內(nèi)膜和人不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜組織分離提取基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，免疫熒光檢測(cè)Vimentin和Cytokeratin7進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞純度鑒定。
　　5.體外誘導(dǎo)蛻膜化：利用雌、孕激素對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠和人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)蛻膜化

6、，運(yùn)用熒光定量 PCR、免疫印跡法、免疫熒光等方法檢測(cè)相關(guān)蛻膜化因子 dtprp、IGFBP1、PRL、Desmin的表達(dá)，分析slp-2與蛻膜化的關(guān)系。
　　6.轉(zhuǎn)染特異性slp-2 siRNA敲低SLP-2表達(dá)，分析SLP-2表達(dá)對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖、分化（蛻膜化）的影響。
　　結(jié)果：
　　1. slp-2在孕早期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示slp-2在D1，D4主要表達(dá)于腺上皮和腔上皮，在D5著床點(diǎn)(IS)主

7、要表達(dá)于子宮內(nèi)膜初級(jí)蛻膜區(qū)（PDZ），在D6IS, D8IS slp-2的表達(dá)逐漸從初級(jí)蛻膜區(qū)(PDZ)轉(zhuǎn)向次級(jí)蛻膜區(qū)(SDZ)。在D5和D6的著床旁（IIS），slp-2的表達(dá)模式與D1相似，表達(dá)于腔上皮和腺上皮。免疫印跡和RT-qPCR結(jié)果顯示slp-2在D5IS，D6IS，D8IS表達(dá)量上調(diào)，分別比其對(duì)應(yīng)的IIS表達(dá)高。
　　2. slp-2在假孕小鼠模型中的表達(dá)：slp-2在假孕PD1，PD4的表達(dá)與 D1，D4中相似，均

8、表達(dá)于腔上皮和腺上皮。在 PD5，PD6，PD8子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。
　　3. slp-2在誘導(dǎo)蛻膜化小鼠模型中的表達(dá)：免疫組化，免疫印跡， RT-qPCR顯示，與未誘導(dǎo)一側(cè)子宮相比較，slp-2顯著高表達(dá)于誘導(dǎo)蛻膜化一側(cè)。
　　4. slp-2在小鼠和人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型中的表達(dá)：RT-qPCR、Western blot結(jié)果顯示，在加入雌孕激素誘導(dǎo)蛻膜化實(shí)驗(yàn)組中小鼠和人的相關(guān)蛻膜化因子 dtprp

9、，IGFBP1，PRL，Desmin表達(dá)升高。Slp-2在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高。
　　5.轉(zhuǎn)染slp-2 siRNA實(shí)驗(yàn)：RT-qPCR，Western Blot結(jié)果顯示，敲低slp-2后，小鼠和人相關(guān)蛻膜化標(biāo)志基因 dtprp，IGFBP1，PRL在體外誘導(dǎo)蛻膜化條件下，表達(dá)顯著低于slp-2未敲低組。
　　6.用EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，體外誘導(dǎo)蛻膜化的基礎(chǔ)上敲除slp-2實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力顯