TERT促耳蝸前體細胞增殖及其機制研究.pdf

1、哺乳動物耳蝸毛細胞為終末感覺細胞，一旦損傷便難以再生，利用潛在的內源性干細胞替代損傷毛細胞可能成為最有潛力的治療策略。近年來，研究者們已經成功的從出生后早期的哺乳動物耳蝸中分離出具有干細胞功能的耳蝸前體細胞，并證實其在體外增殖，并可誘導分化成為毛細胞樣細胞。然而耳蝸前體細胞并非真正意義上的干細胞，而是介于干細胞和終末細胞之間的一類細胞亞型，其增殖能力有限，隨著細胞的有絲分裂而逐漸退出細胞周期。因此，如何維持耳蝸前體細胞的增殖能力成為研究

2、的焦點。隨著耳聾基礎研究的深入，一些耳蝸發(fā)育相關的基因已被證實可以促進耳蝸前體細胞的增殖，在研究中我們檢測了在SD大鼠耳蝸發(fā)育過程和體外培養(yǎng)的耳蝸前體細胞中 TERT的表達變化，結果提示隨著耳蝸的發(fā)育和耳蝸前體細胞增殖能力的降低 TERT的表達逐漸降低。通過腺病毒轉染技術將TERT轉染進入體外培養(yǎng)的耳蝸前體細胞，證實過表達TERT可以促進耳蝸前體細胞的增殖，并初步證實Rb/E2F信號通路可能參與了TERT對耳蝸前體細胞增殖的調控。

3、>　　實驗一新生 SD大鼠耳蝸前體細胞的分離、培養(yǎng)
　　目的：
　　采用聯合酶消化的方法建立新生大鼠耳蝸前體細胞的分離培養(yǎng)方法，以改善原有耳蝸前體細胞的分離、培養(yǎng)方法；
　　方法：
　　分離P1-P3 SD大鼠耳蝸基底膜，將基底膜分為四組，分別為：A組：嗜熱菌蛋白酶消化組；B組：Ⅰ型膠原酶消化組；C組：嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化組；D組：嗜熱菌蛋白酶消化+機械分離組。根據不同的分組進行酶消化和細胞分離，收集細胞

4、進行懸浮培養(yǎng)和誘導分化，觀察培養(yǎng)獲得的細胞球數目，上皮細胞的純度、細胞的增殖和定向分化能力。
　　結果：
　　從4種方法分離得到的細胞經培養(yǎng)后均可形成細胞球，表達干細胞標記物Nestin和細胞分裂標記物BrdU。經過誘導分化后基底膜上皮細胞可以分化成毛細胞樣細胞和支持細胞，而間質細胞可以分化為神經元樣細胞。采用嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶聯合消化可以獲得最多數量的細胞球，并證實這些細胞球為上皮來源，各組細胞的上皮細胞陽性率無顯著

5、差異。
　　結論：
　　采用嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶聯合消化基底膜可以獲得較高純度的上皮細胞，顯著提高耳蝸前體細胞的分離效率，該方法改善了原有耳蝸前體細胞的培養(yǎng)方法，為耳蝸前體細胞的研究提供了有力工具。
　　實驗二 TERT在耳蝸發(fā)育過程中及耳蝸前體細胞增殖中的表達
　　目的：
　　TERT對于維持端粒酶活性具有關鍵作用，已被證實可以促進多種細胞的增殖，而其在內耳細胞中的作用并不清楚。該實驗的目的是檢測 T

6、ERT在大鼠耳蝸發(fā)育過程中及耳蝸前體細胞培養(yǎng)過程中的表達變化。
　　方法：
　　我們采用分別RT-PCR和Western blot檢測了TERT在P0，P3，P7，P14，P28 SD大鼠耳蝸基底膜中的表達變化。同時分離培養(yǎng)大鼠耳蝸前體細胞，采用RT-PCR檢測了在不同培養(yǎng)時間，不同細胞球類型及不同傳代的前體細胞中 nestin，PCNA及TERT的表達變化。
　　結果：
　　在出生后早期可以見到基底膜中有較低水

7、平的 TERT的表達，隨著耳蝸發(fā)育其表達水平逐漸降低。體外培養(yǎng)的耳蝸前體細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞傳代，其nestin，PCNA及TERT的表達逐漸下降，鏤空細胞球中TERT的表達水平顯著低于混合性細胞球組及實性細胞球組。
　　結論：
　　TERT在出生后早期可有較低水平的表達，而隨著耳蝸的發(fā)育其表達逐漸降低，提示 TERT可能與耳蝸的發(fā)育有關。耳蝸前體細胞隨著培養(yǎng)時間的延長及傳代其增殖能力和干細胞特性降低，同時伴有TER

8、T的表達下降，提示TERT可能與耳蝸前體細胞干細胞功能的維持有關。
　　實驗三 Ad-TERT-EGFP的構建和大鼠耳蝸前體細胞的轉染
　　目的：
　　構建攜帶目的基因為 TERT的腺病毒載體，體外轉染培養(yǎng)的大鼠耳蝸前體細胞，觀察轉染效率及細胞狀態(tài)，確定適當的轉染滴度。
　　方法：
　　1、構建復制缺陷重組腺病毒：Ad-TERT-EGFP及Ad-EGFP;
　　2、應用不同感染復數的Ad-EGFP（M

9、OI=250、200、150、100、50、25）轉染耳蝸前體細胞，觀察不同滴度轉染時前體細胞形態(tài)的變化，熒光顯微鏡觀察EGFP表達情況，確定轉染MOI值，計算陽性細胞的轉染率；
　　3、應用 RT-PCR、Western blot檢測 Ad-TERT-EGFP轉染后耳蝸前體細胞中TERT的表達情況，用TRAP-ELISA檢測轉染后耳蝸前體細胞中端粒酶活性的變化。
　　結果：
　　收集病毒上清液經過鑒定，證實該重組腺病

10、毒攜帶目的基因片段，病毒滴度為1×1011pfu/ml。在不同的感染復數下，EGFP的陽性細胞的比例隨著 MOI值增加而不斷升高，當MOI值等于或者低于200時，病毒轉染組與對照組細胞形態(tài)無明顯差異。而當MOI>250時，病毒轉染組細胞出現貼壁，生長抑制，壞死。確定本實驗 MOI值為200，轉染后3-4天轉染效果達到最佳，轉染效率為32.15±3.12％。以 MOI=200將 Ad-TERT-EGFP轉染耳蝸前體細胞，RT-PCR和We

11、stern blot檢測耳蝸前體細胞中TERT mRNA和蛋白的表達顯著升高，而端粒酶活性卻沒有顯著變化。
　　結論：
　　應用腺病毒轉染技術可以成功轉染耳蝸前體細胞，轉染后前體細胞中TERT的表達顯著升高，為進一步研究TERT對耳蝸前體細胞增殖能力的影響奠定了基礎。
　　實驗四過表達 TERT對耳蝸前體細胞增殖能力的影響
　　目的：
　　通過攜帶TERT的腺病毒將TERT轉染至體外培養(yǎng)的耳蝸前體細胞，觀察

12、過表達TERT后耳蝸前體細胞增殖能力的改變。
　　方法：
　　將耳蝸前體細胞分成三組：Ad-TERT-EGFP轉染組；Ad-EGFP轉染組；對照組，對各組細胞分別進行病毒轉染，MOI=200，然后分別計數耳蝸前體細胞各類細胞球所占比例，MTT繪制生長曲線，EdU染色、RT-PCR及Western blot檢測前體細胞中PCNA的表達。
　　結果：
　　結果表明進行Ad-TERT-EGFP轉染后7天，耳蝸前體細胞中

13、實性細胞球所占比例比Ad-EGFP轉染組及對照組顯著升高（P<0.05)，MTT結果也提示過表達TERT后，耳蝸前體細胞的增殖能力顯著增強。EdU染色提示Ad-TERT-EGFP轉染組耳蝸前體細胞中 EdU陽性的細胞百分率顯著高于 Ad-EGFP組及對照組，RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現在Ad-TERT-EGFP轉染組中PCNA的表達顯著高于Ad-EGFP組及對照組。
　　結論：
　　過表達TERT可以促進耳

14、蝸前體細胞的增殖。
　　實驗五 TERT促進耳蝸前體細胞增殖的機制
　　目的：
　　研究轉染Ad-TERT-EGFP耳蝸前體細胞后促進前體細胞增殖的可能機制。
　　方法：
　　應用 RT-PCR檢測 Ad-TERT-EGFP轉染組，Ad-EGFP轉染組及對照組中P27KIP1、P53、Rb、E2F、β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、P16INK4a mRNA的表

15、達水平變化，采用Western blot檢測P27KIP1、P53、Rb、E2F、Cyclin D1、β-catenin蛋白的表達水平變化。
　　結果：
　　RT-PCR結果提示過表達 TERT后，耳蝸前體細胞中 P27KIP1、P53、P16INK4a表達水平較Ad-EGFP轉染組及對照組顯著降低（P<0.05），而CDK2、Cyclin D1的表達較 Ad-EGFP轉染組及對照組升高。Western blot結果提示：過