PKR抗羊痘病毒作用及與K3L蛋白作用關(guān)系的研究.pdf

1、羊痘（Capripox）是由羊痘病毒（Capripoxvirus）引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物疫病。羊痘病毒為痘病毒科（Poxviridae）脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）羊痘病毒屬（Capripoxvirus）成員，包括綿羊痘病毒（Sheeppox virus）、山羊痘病毒（Goatpox virus）和牛結(jié)節(jié)性疹塊病病毒（Lump skin disease vi

2、rus）。
　　干擾素（IFN）誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR）是哺乳動物4種絲氨酸/蘇氨酸激酶之一（其他3個分別為HRI，GCN2和PERK），它能夠識別細(xì)胞應(yīng)激和病毒感染，并作用于真核起始因子eIF2α，使其發(fā)生磷酸化，從而抑制病毒蛋白的合成。
　　羊痘是動物痘病中十分嚴(yán)重的一種，目前關(guān)于PKR對羊痘病毒作用的研究甚少。本

3、研究通過檢測綿羊痘病毒（SPPV）感染后細(xì)胞內(nèi)PKR-eIF2α的變化，檢測過表達(dá)及通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)PKR蛋白表達(dá)后對SPPV復(fù)制的影響，驗證SPPV K3L蛋白與PKR之間的相互作用，旨在綜合評價PKR在細(xì)胞抗羊痘病毒復(fù)制中的作用。
　　1、 SPPV感染后對細(xì)胞內(nèi)PKR-eIF2α的影響的研究。
　　SPPV感染HeLa細(xì)胞，通過Western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)PKR及eIF2α蛋白水平及其磷酸化水平的變化，

4、結(jié)果表明：SPPV感染能夠引起PKR及eIF2α磷酸化水平明顯升高，且具有劑量相關(guān)性，而經(jīng)過紫外滅活的SPPV未能激活PKR通路。說明PKR的激活需要SPPV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA是PKR的活化劑。
　　2、細(xì)胞感染SPPV后PKR的作用研究。
　　為了驗證PKR在細(xì)胞感染SPPV后的作用，本研究進(jìn)行了PKR過表達(dá)或利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)PKR蛋白表達(dá)，接種SPPV GL毒株后檢測病毒蛋白的表達(dá)及SPPV

5、的復(fù)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在PKR過表達(dá)的HeLa細(xì)胞中，SPPV GL毒株病毒的復(fù)制水平比對照組細(xì)胞降低，病毒蛋白表達(dá)下降；而PKR沉默則促進(jìn)了病毒的復(fù)制。證明PKR對細(xì)胞內(nèi)的SPPV復(fù)制有抑制作用。
　　3、 PKR在SPPV感染過程中誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生的研究。
　　本試驗通過實時熒光定量PCR檢測PKR下調(diào)后接種SPPV細(xì)胞內(nèi)IFN-βmRNA水平。結(jié)果顯示：與對照組相比，PKR蛋白表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中，IFN-βmRNA水平顯著降

6、低，證明PKR能夠誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。
　　4、 PKR與羊痘病毒K3L蛋白作用關(guān)系的研究。
　　痘苗病毒的K3L蛋白在結(jié)構(gòu)上與PKR的自然底物eIF2α相似，可作為“假底物”與PKR結(jié)合，從而抑制PKR的作用。為了確定羊痘病毒的K3L蛋白是否也與PKR存在相互作用，本研究通過間接免疫熒光和免疫共沉淀試驗證明了羊痘病毒K3L蛋白與細(xì)胞內(nèi)的PKR重合表達(dá)，且蛋白定位在細(xì)胞核，并通過Western-blot方法確定了兩者存在相