NCC抗柯薩奇病毒B3的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是一種心肌疾病，一般是被病毒感染而導(dǎo)致且發(fā)病率非常高，目前常見發(fā)病于兒童和青少年。VMC可以被多種病毒誘發(fā)。如粘病毒、腸道病毒和腺病毒等等。其中，腸道病毒中的柯薩奇B3型病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）較為常見。CVB3病毒是無包膜的單鏈RNA病毒，常經(jīng)消化道或呼吸道進(jìn)入人體并使之感染。病毒性心肌炎在臨床上主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞的壞死，部分患者的發(fā)病

2、初期沒有明顯癥狀，但隨著病情的持續(xù)發(fā)展，可能出現(xiàn)心律失常、心功能不全、房室阻滯、休克等癥狀，嚴(yán)重者甚至猝死。孕婦若感染則能夠發(fā)生非麻痹性脊髓灰質(zhì)炎性病變，使胎兒在子宮內(nèi)受到感染并能導(dǎo)致畸形。VMC現(xiàn)已嚴(yán)重威脅著人類的健康，但對于VMC的發(fā)病機(jī)制，目前還不明確，臨床上也缺少特效的治療藥物。因此，闡明 VMC發(fā)病機(jī)制和開發(fā)研制新型特異性的抗病毒性心肌炎藥物是當(dāng)前的重要任務(wù)。
　　NCC是一種新型核苷類似物，在前期研究中已經(jīng)被證實(shí)在體外

3、細(xì)胞模型中具有很好的抗 CVB3活性。本課題成功構(gòu)建病毒性心肌炎體外模型，通過三種不同的給藥方式，探究了藥對CVB3吸附作用的影響、藥對CVB3生物合成的影響以及藥對 CVB3的直接作用。通過檢測 NCC對 CVB3，進(jìn)一步探討 NCC對CVB3感染的宿主細(xì)胞凋亡情況的影響并通過RT-PCR和Western-Blot進(jìn)一步研究NCC抗CVB3的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.分別采用先加藥再加病毒，先加病毒再加藥，藥物對病毒

4、直接作用三種不同給藥方式，通過MTT法檢測NCC對CVB3的作用。
　　2.選用CVB3病毒感染對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞。然后用流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測NCC對CVB3 TLR3、TLR7、MDA-5表達(dá)水平的影響。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western-Blot）檢測MAPK蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建CVB3體外細(xì)胞模型。TCID

5、50=10-6.3
　　2.三種給藥方式結(jié)果：NCC TC50為1.27 mM。計(jì)算NCC對CVB3的IC50值，先加藥后加病毒，最后加入培養(yǎng)基的方法：測得IC50值為20.04 mM，TI為0.06；先加病毒后加藥液持續(xù)培養(yǎng)的方法：測得IC50值為25.27μM，TI為50.26；先將病毒與藥液混合2h后加入細(xì)胞，再加入培養(yǎng)基的方法：測得IC50值為223.68μM， TI為5.68。
　　3.線粒體膜電位檢測結(jié)果：與病毒

6、對照組相比，NCC作用后，線粒體膜電位均明顯升高(P＜0.05)。
　　4.RT-PCR檢測結(jié)果：與病毒對照組相比，NCC作用于CVB3感染的Hela細(xì)胞后，細(xì)胞相關(guān)因子TLR3、TLR7和MDA-5的表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。
　　5.Western-Blot檢測結(jié)果：NCC作用于CVB3感染Hela細(xì)胞后，p44/42 MAPK（Erk1/2）的蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.