小鼠β防御素-3體外抗柯薩奇病毒作用的實驗研究.pdf

1、目的：建立柯薩奇病毒感染人宮頸癌細胞（Hela細胞）的體外細胞模型，用重組β防御素-3多肽（recombinant mouseβ-defensin3，rMBD-3）在病毒增殖周期的不同階段進行干預，探索 rMBD3的體外抗柯薩奇病毒作用。
　　方法：1. rMBD-3的鑒定，運用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分析rMBD-3的分子量和純度，并運用鱟試驗檢測rMBD-3的內(nèi)毒素含量和BCA法測定rMBD-3的含量；2.測定柯薩

2、奇病毒的增殖及半數(shù)組織細胞感染量(50％ tissue culture infection dose,TCID50)，將柯薩奇病毒A16型（coxsackie virus A16,CVA16）和B3型（coxsackie virus B3,CVB3）接種于Hela細胞單層培養(yǎng)物使病毒活化增殖后收集培養(yǎng)液，并用 Reed-Muench方法測定增殖后的CVA16和CVB3對 Hela細胞的TCID50確定病毒的滴度；3. rMBD-3的細胞

3、毒性測定，將Hela細胞接種至96孔細胞板，同時加入終濃度為25-200μg/ml的rMBD-3，37℃、5%CO2培養(yǎng)48小時，用MTT法測定細胞的增殖活性，確定rMBD-3對細胞的無毒濃度范圍；4.將各濃度rMBD-3分別和CVA16、CVB3混合后在4℃孵育2小時，然后加入Hela細胞單層物，37℃孵育1小時使病毒吸附后棄上清，加入1640維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，觀察各孔的細胞病變效應，并用MTT法測定各孔的光吸收度值，檢

4、測 rMBD-3對柯薩奇病毒的直接作用；5.將各濃度 rMBD-3和病毒分別混合后的混合液直接加入細胞單層物，37℃孵育1小時棄上清換成1640維持液，相同方法測定各孔的光吸收度值，檢測rMBD-3在柯薩奇病毒吸附階段的抑制作用；6.先將病毒液加入各孔細胞單層物，37℃孵育1小時棄多余病毒液，加入各濃度rMBD-3和1640維持液的混合液，37℃孵育2小時棄上清換成維持液，相同方法測定各孔的光吸收度值，檢測rMBD-3在柯薩奇病毒穿入階

5、段的抑制作用；7.先將病毒液加入各孔細胞單層物，37℃孵育1小時棄上清換成維持液，37℃孵育2小時棄上清，加入各濃度rMBD-3和維持液的混合液，相同方法測定各孔光吸收度值，檢測rMBD-3在柯薩奇病毒穿入細胞后對病毒的抑制作用。同時設計兩種抗病毒陽性藥物（干擾素和利巴韋林）、病毒對照及空白（正常細胞）對照。
　　結(jié)果：1.在凝膠電泳圖上可見較單一的分子量約為4.5KDa的蛋白質(zhì)條帶,純度大于90%，內(nèi)毒素含量小于0.001EU/

6、ug；2.病毒感染細胞后48-72小時可見細胞出現(xiàn)明顯變圓變大、脫落、出現(xiàn)聚合細胞等細胞病變現(xiàn)象。測得CVA16和CVB3對 Hela細胞的TCID50分別為10-3.5/0.1ml和10-5.8/0.1ml；3.確定 rMBD-3對 Hela細胞的無毒濃度范圍為25-100μg/ml，后續(xù)的抗病毒實驗rMBD-3用100、50、25、12.5、6.25μg/ml5個濃度；4. MTT法測得的光吸收度值與活細胞數(shù)量呈正相關(guān)，各組數(shù)據(jù)之間

7、的比較采用單因素方差分析，得出：與病毒對照相比，經(jīng)過同rMBD-3前孵育處理的病毒感染細胞后對細胞的致死作用有所降低；5.在病毒感染細胞的吸附階段，用rMBD-3干預后病毒對細胞的致死作用有所降低；6.在病毒感染細胞的穿入階段用rMBD-3進行干預，病毒對細胞的致病變作用也有所降低；7.在病毒穿入細胞后加入rMBD-3進行干預，病毒對細胞的致死作用與病毒對照相比無明顯差異。
　　結(jié)論：實驗證實了rMBD-3具有體外抗柯薩奇病毒作用