釀酒酵母轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入突變體菌株263-H9中高鹽脅迫應(yīng)答基因的探尋.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文釀酒酵母轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入突變體菌株263-H9中高鹽脅迫應(yīng)答基因的探尋姓名：于典科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：鮑曉明20050518山東大學(xué)碩士學(xué)位論文釀酒酵母轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入突變體菌株2 6 3 - H 9 中高鹽脅迫應(yīng)答基因的探尋摘 要目前，研究高鹽等逆境脅迫下細(xì)胞的抗逆應(yīng)答機(jī)理成為生命科學(xué)的熱點(diǎn)之一，各種新的研究技術(shù)與研究成果不斷涌現(xiàn)。轉(zhuǎn)座標(biāo)簽技術(shù)是根據(jù)轉(zhuǎn)座子隨機(jī)引起插入突變的特性而發(fā)展起來(lái)的正向遺傳篩選的

2、新策略，目前應(yīng)用較多的是以細(xì)菌T n 3 轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)改造而成的m T n 3 轉(zhuǎn)座標(biāo)簽系列。m T n 3 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽屬于隨機(jī)性的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，適用于大規(guī)模探尋功能基因。本實(shí)驗(yàn)室前期工作以釀酒酵母W 3 0 3 ．1 A 為出發(fā)菌株，利用轉(zhuǎn)座標(biāo)簽技術(shù)，篩選得到6 1 株對(duì)高鹽脅迫敏感的釀酒酵母突變菌株。其中突變菌株2 6 3 ．H 9 的轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入點(diǎn)位于G I P 2 編碼框下游8 4 0 b p 、Y E R ∞3 C - A 上游

3、1 6 7 b p 的基因間隔區(qū)域內(nèi)。S o u t h e r n雜交等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2 6 3 ．H 9 突變體只含一個(gè)轉(zhuǎn)座標(biāo)簽。本文采用K a n M X 4 系統(tǒng)設(shè)計(jì)引物，分別敲除插入突變體2 6 3 ．H 9 中與轉(zhuǎn)座標(biāo)簽緊密連鎖的y E 足O j j ( 卅與G 妒2 基因，所得到的缺失突變體分別命名為D W - 1 0 1 與D W - 1 0 2 。梯度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明，2 6 3 ．H 9 對(duì)I ．5 m o l ／LS

4、o r b i m l 高滲透壓脅迫、O ．6 5 m o l ／L高鹽脅迫與1 5 ℃低溫脅迫具有很強(qiáng)的敏感性表型特征，而缺失突變體D W - 1 0 1 與D W - l 0 2 對(duì)上述脅迫條件并不敏感。隨后我們分別對(duì)出發(fā)菌株W 3 0 3 ．1 A 和突變體2 6 3 一H 9 ，采用K a n M X 4 系統(tǒng)分別在轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入位點(diǎn)插入G 4 1 8 抗性基因，菌株分別命名D W - 1 0 0 和D W ．1 0 3 。梯度生

5、長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D W o l 0 3 仍然表現(xiàn)出對(duì)多種脅迫條件的敏感表型。但從W 3 0 3 ．1 A獲得的與之相同位點(diǎn)的突變體D W - 1 0 0 ，則沒(méi)有表現(xiàn)出相應(yīng)的敏感表型。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2 6 3 ．H 9 對(duì)多種脅迫條件的敏感表型不是由于轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的插入引起的，因?yàn)? 6 3 一H 9 菌株中僅有一個(gè)轉(zhuǎn)座標(biāo)簽，推測(cè)可能在轉(zhuǎn)座過(guò)程中染色體其他部位發(fā)生突變。為了探尋2 6 3 ．H 9 真正引起表型突變的突變位點(diǎn)，根據(jù)所需篩