重組蓖麻毒素A鏈拮抗分子的設(shè)計(jì).pdf

1、蓖麻毒素(ricin)是從植物蓖麻子中分離得到的一種Ⅱ型核糖體失活蛋白，其A鏈(RA)為效應(yīng)鏈，具有N-糖苷酶活性，通過催化28SrRNAS/R結(jié)構(gòu)域第4324位脫去一個(gè)保守的腺嘌呤，使核糖體60S亞基失活，從而阻斷蛋白質(zhì)合成途徑引起細(xì)胞死亡。RA因其高細(xì)胞毒性，常常用于制備免疫毒素藥物(ITs)，尤其在惡性腫瘤的生物治療上具有誘人的應(yīng)用前景；或可能被用作恐怖襲擊的生物戰(zhàn)劑。然而，由于RA對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非特異性殺傷作用，不可避免出現(xiàn)一

2、些治療副反應(yīng)，如血管滲漏綜合癥等。研制針對(duì)RA的拮抗分子，有助于緩解這些臨床副作用，并對(duì)蓖麻毒素生物恐怖襲擊的偵檢、治療及預(yù)防提供必要的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究基于RA與底物相互作用復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，通過計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)(CAMD)的方法合理設(shè)計(jì)了兩類針對(duì)RA的拮抗分子，即拮抗肽PT，以及在CDR3區(qū)插入拮抗肽的重組人重鏈單域抗體(rVHPT)。研究?jī)?nèi)容概要如下：1.對(duì)重組蓖麻毒素A鏈基因進(jìn)行了成功的克隆、表達(dá)、純化以及功能鑒

3、定，建立了用于篩選RA拮抗分子的生物學(xué)評(píng)價(jià)平臺(tái)，即體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與無(wú)細(xì)胞系中熒光素酶蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)。 2.基于RA的晶體結(jié)構(gòu)信息與定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，初步確定以四個(gè)氨基酸殘基(E177，R180，Y80，Y123)為主的RA生物活性功能域。針對(duì)這一結(jié)構(gòu)域，合理設(shè)計(jì)了兩類RA拮抗分子，即PT與rVHPT，理論模擬的結(jié)果顯示它們能明顯阻斷RA-rRNA相互作用。 3.分別制備合成PT、原核表達(dá)rVHPT，并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)

4、驗(yàn)，結(jié)果表明二者均能顯著競(jìng)爭(zhēng)抑制rRA與其相應(yīng)抗體的結(jié)合。無(wú)細(xì)胞系中熒光素酶蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，給予50％蛋白合成抑制率的rRA用量時(shí)，0.1mg/mL的PT即能使蛋白合成率恢復(fù)至80％以上。而體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)也表明，rVHPT能顯著抑制rRA對(duì)SP2/0與SKO-007等的細(xì)胞毒性效應(yīng)。 本研究著重討論了運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)的方法來設(shè)計(jì)針對(duì)RA的拮抗分子，并建立快捷、敏感、穩(wěn)定、定量的生物學(xué)評(píng)價(jià)平臺(tái)，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)更有