蓖麻毒素和相思子毒素的提取純化及基于生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定方法的建立.pdf

1、蓖麻毒素和相思子毒素均屬一種植物蛋白毒素，由A、B兩條多肽鏈通過二硫鍵連接構(gòu)成，A鏈?zhǔn)腔钚枣?，具有糖苷酶活性；B鏈為結(jié)合鏈，含有兩個(gè)半乳糖結(jié)合位點(diǎn)。蓖麻毒素和相思子毒素均屬于Ⅱ型核糖抑制類蛋白家族(RIPⅡ)，能夠抑制細(xì)胞蛋白合成而具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。針對(duì)這一性質(zhì)，臨床上多利用A鏈與導(dǎo)向分子如抗體相連構(gòu)建免疫毒素，將單克隆抗體的特異結(jié)合性與毒素A鏈的強(qiáng)烈殺傷作用結(jié)合，發(fā)展導(dǎo)向藥物，具有十分廣泛的臨床應(yīng)用前景。 另外，由于蓖麻類毒

2、素具有極強(qiáng)的毒性，且種植廣泛，提取制備方法公開，極易被恐怖組織利用，作為生物戰(zhàn)劑進(jìn)行恐怖襲擊。蓖麻毒素和相思子毒素均已被美國(guó)疾病控制中心(CDC)列入潛在生物戰(zhàn)劑清單之中。在目前沒有特效藥和解毒藥的形勢(shì)下，發(fā)展新的快速、有效的偵檢、鑒定蓖麻類毒素的方法，具有十分現(xiàn)實(shí)的研究意義。 本課題即是針對(duì)這兩種毒素，對(duì)傳統(tǒng)提取純化方法進(jìn)行優(yōu)化、改進(jìn)，建立了實(shí)驗(yàn)室制備技術(shù)；并基于生物質(zhì)譜技術(shù)，建立對(duì)蓖麻類毒素的檢測(cè)鑒定方法。本課題的第一部分，

3、主要建立了蓖麻毒素的提取和純化路線。根據(jù)蓖麻毒素對(duì)半乳糖的特異性結(jié)合能力，采用親和層析技術(shù)將蓖麻種子中大部分雜質(zhì)除去；由于在植物種子中蛋白毒素總是與凝集素并存，繼而我們又根據(jù)二者分子量的差異進(jìn)行了凝膠過濾層析，去除凝集素，純化得到電泳純的蓖麻毒素，并對(duì)蓖麻毒素的純度和活性進(jìn)行了考察。 在論文的第二部分，開展了對(duì)蓖麻毒素生物質(zhì)譜鑒定方法學(xué)的建立。主要確定了兩條技術(shù)路線：其一是基于MALDI-TOF/MS技術(shù)，對(duì)蓖麻毒素進(jìn)行SDS-

4、PAGE分離后，經(jīng)過還原、烷基化、膠內(nèi)酶切、肽段提取等一系列處理過程，MALDI-TOF/MS測(cè)定提取肽段，獲得肽質(zhì)量信息，通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，進(jìn)行PMF鑒定；其二是基于ESI/MS技術(shù)，將純化的蓖麻毒素直接在溶液內(nèi)還原、烷基化、酶切處理，肽混合物進(jìn)入HPLC分離，獲得蓖麻毒素胰酶解HPLC肽譜，ESI-MS在線鑒定，獲得各肽片段的HPLC保留時(shí)間及質(zhì)量信息，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蓖麻毒素的鑒定。 相思子毒素類似于蓖麻毒素，因此第三部分的工作

5、主要是借鑒蓖麻毒素的提取鑒定方法，完成對(duì)相思子毒素的方法建立。對(duì)于相思子毒素的純化過程，我們對(duì)純化方法進(jìn)行優(yōu)化，一步除去凝集素，并通過離子交換層析得到兩種不同亞型的相思子毒素(Abrin-a，Abrin-b)；對(duì)提取的毒素進(jìn)行了純度和活性的考察；基于MALDI-TOF/MS技術(shù)，對(duì)兩種不同亞型的相思子毒素進(jìn)行了PMF的鑒定。 總之，通過本課題的研究，確定了蓖麻類毒素提取、純化的實(shí)驗(yàn)室制備技術(shù)，并建立了生物質(zhì)譜方法對(duì)蓖麻毒素和相思