腫瘤基因治療的基本策略和常用方法

1、腫瘤基因治療的基本策略和常用方法,臨五1604 張湘鈺 鄒穎,CONTENTS,腫瘤基因治療的基本策略和常用方法,01,腫瘤和基因治療的基本概念,01 腫瘤,機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。,01 基因治療,指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的，腫瘤的基因治療是將目

2、的基因?qū)氚屑毎?使其在體內(nèi)表達并發(fā)揮特定的功能,殺傷或抑制腫瘤細胞從而達到治療的目的,02,腫瘤基因治療的基本策略,,,,,01,02,03,04,采用基因打靶技術(shù)矯正突變的抑癌基因中的突變序列,將外源性的正常抑癌基因直接導入腫瘤細胞，取代突變的抑癌基因而發(fā)揮作用，以改變腫瘤細胞的惡性表型,利用基因干擾技術(shù)等抑制異常表達的癌基因或腫瘤相關(guān)基因，降低其表達活性或使其不表達,基因失活,又稱基因轉(zhuǎn)移，是指將外源性目的基因?qū)氚┳兗毎ㄟ^目

3、的基因表達產(chǎn)物修飾缺陷細胞，使其恢復功能或原有功能得到加強基因型修飾是應用最廣泛的一個策略。,03,常用方法,,,1、基因干預技術(shù),（1）反義RNA技術(shù) 如何獲得反義RNA： ① 體外構(gòu)建反義RNA表達載體，將其導入腫瘤 細胞并表達反義RNA

4、 ② 體外合成反義RNA，將其導入靶細胞，對表 達異常的癌細胞產(chǎn)生抑制效應。,1、基因干預技術(shù),反義RNA技術(shù)在基因治療中需解決的首要問題： ① 專一性轉(zhuǎn)移問題 ：如何專一性的對病灶處病變的細胞進行處

5、 理，而不影響其它正常細胞 ② 反義RNA在進入靶細胞前的降解問題：反義RNA抗RNase的 能力不強

6、 ③ 安全性問題,1、基因干預技術(shù),受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù) 受體介導的細胞吞噬作用：細胞膜上存在一些專一性受體是組織或器官特異的，這些受體專一性的與相應配體結(jié)合后，所形成的受體配體復合物就會在細胞膜上某些特定區(qū)域富集，通過細胞吞噬作用，實現(xiàn)這些配體向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移 特點：①具有細胞、組織或器官專一性，配體

7、 只能被一些特異的細胞吞噬 ②配體進入細胞的轉(zhuǎn)移效率很高,,脫唾液酸血清類黏蛋白（ASGP）受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移,1、基因干預技術(shù),反義DNA技術(shù)治療腫瘤的三個設想： ① 封閉異常表達的癌基因 ② 癌基因的異位和重排部位

8、是反義RNA治療的理想目標 ③ 抑制腫瘤細胞耐藥性，從而提高化學治療效果,1、基因干預技術(shù),⑵、RNA干擾技術(shù),RNA干擾( RNA interference,RNAi ) 是指在進化過程中高度保守的,由雙鏈RNA ( dsRNA) 誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi使特定基因沉默,是真核細胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制,這種由21 ~ 23 個核苷酸長

9、度介導的小RNA常被稱為小干擾RNA( siRNA) ,其序列在真核生物進化中高度保守。將長dsRNA或短siRNA遞送進入生物體細胞內(nèi)均可引發(fā)RNA i，進而使特定基因表達沉默,基于RNAi的腫瘤治療應用于臨床,有兩個關(guān)鍵問題亟需解決: 首先,如何高效向腫瘤細胞或組織遞送干擾RNA; 其次,如何減少外源性siRNA引起的不良反應。,1、基因干預技術(shù),RNAi 作用機制①病毒基因、轉(zhuǎn)座子、人工轉(zhuǎn)入基因等外源基因隨機整合到宿主細胞基因組

10、內(nèi),并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時常產(chǎn)生一些dsRNA 。② siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,然后由反義鏈與胞內(nèi)一些酶( 包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等) 結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物 （RISC）③此時RISC具有核酸酶的功能,能在結(jié)合部位切割mRNA,切割位點是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解,進而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應,1、基因干預技術(shù),RNAi理想遞送系

11、統(tǒng) ① 適配體——RNAi的嵌合體。適配體能與多種目標物質(zhì)高特異性、高選擇性結(jié)合② 穩(wěn)定核酸脂質(zhì)復合物（SNALPs），對脂類復合物進行聚乙二醇（PEG）修飾使得復合物獲得親水性外層，從而增強其在血漿中的穩(wěn)定性,如何高效地向腫瘤細胞或組織遞送干擾RNA,?,1、基因干預治療,如何解決RNAi存在的安全問題,?,1、克服siRNA的脫靶問題 siRNA可引起一些非靶基因的特異性沉默或表達上調(diào)，引起細胞凋亡或生長抑

12、制，這種現(xiàn)象叫做脫靶效應 解決脫靶效應的潛在方法： ⑴ 最新發(fā)現(xiàn)的siRNA領域轉(zhuǎn)移優(yōu)化策略 ⑵ 改變siRNA濃度 ⑶ siRNA設計2、克服RNAi引起的免疫反應 siRNAs是哺乳動物固有免疫系統(tǒng)的有力激活劑

13、，能誘導產(chǎn)生高水平的炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素。 解決方法： ⑴ 用免疫刺激的siRNA來避免誘發(fā)的相關(guān)免疫反應，通過選擇免疫缺乏刺激基序的序列，設計出無免疫刺激活性的siRNA ⑵通過化學修飾來穩(wěn)定siRNA,2、自殺基因治療,,基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導入某些真核細胞中不存在的酶基因，這些基因表達的特異性酶可以催化對真核細胞無毒或低毒的藥物前提，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?/p>

14、抗代謝藥物，進而選擇性的地使轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細胞“自殺”。旁觀者效應：導入有自殺基因的腫瘤細胞對鄰近的未導入自殺基因的腫瘤細胞有殺傷作用?？擅黠@擴大自殺基因?qū)δ[瘤細胞的殺傷作用,基本步驟： ⑴ 尋找具有治療意義的目的基因 ⑵ 建立向靶細胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng) ⑶ 目的基因在靶細胞中表達，發(fā)揮生物學效應，達到治療目的

15、,2、自殺基因治療,⑴、常見的自殺基因系統(tǒng)① tk-GCV系統(tǒng)病毒、細菌、真核細胞中都存在胸苷激酶（HSV-tk）。甘昔洛韋(GCV)是臨床上用于治療單純皰疹的藥物。GCV在胸苷激酶的作用下生成三磷酸GCV，能阻斷DNA合成產(chǎn)生細胞毒作用。② CD-5-FC系統(tǒng)胞嘧啶脫氨酶基因(CD)存在于許多細菌和真菌中，5-氟胞嘧啶(5-FC)在微生物體內(nèi)被CD代謝 成5-氟尿嘧啶，后者有明顯的抗腫瘤活性。目前應用最廣泛的是大腸桿菌的CD

16、基因。,2、自殺基因治療,⑵ 、自殺基因的轉(zhuǎn)導 Ⅰ、載體技術(shù) ① 病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移：以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性成為腫瘤治療中應用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒 ② 非病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移：常用的非病毒載體有脂質(zhì)體及多聚陽離子聚合物，具有低免疫、低毒性、無基因插片段大小限制等優(yōu)勢，但缺乏組織的特異性和靶向性，轉(zhuǎn)染效率低且易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，基因表達時間,2、自殺基因治療,Ⅱ、增強基因轉(zhuǎn)導效率

17、 自殺基因治療要求轉(zhuǎn)染的自殺基因要有一定的表達效率，同時能選擇性的表達于靶細胞中，從而最大限度的殺傷腫瘤細胞。目前主要的靶向方法有： ① 靶向性轉(zhuǎn)導 載體攜帶外源基因, 在一定的反應環(huán)境中作用于靶細胞, 完成基因轉(zhuǎn)移這一過程中, 無論是載體、環(huán)境因素還是靶細胞的改變都將影響基因轉(zhuǎn)導效率。 惡性腫瘤細胞常有表面受體的異常表達或腫瘤特異性抗原表達, 將載體與腫瘤表面特異表達、高表達受體相對應的配體或與相對應抗體相連,

18、 將提高外源基因的轉(zhuǎn)導效率 ② 靶向性轉(zhuǎn)錄 基因的表達受到多層次的調(diào)控, 因此外源基因的表達調(diào)控可以通過對多個環(huán)節(jié)進行干預來實現(xiàn)。在自殺基因前端接上腫瘤特異性的啟動子、增強子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件, 可以增強外源基因 在腫瘤中的特異性表達, 以加強自殺基因?qū)δ[瘤細胞的特異性殺傷效力, 同時可以降低它對正常細胞的毒性作用,3、免疫性基因治療,基本策略： 根據(jù)免疫學的理論和技術(shù)，并結(jié)合基因轉(zhuǎn)移和基因表達調(diào)控等分子生物學方法，以激發(fā)機體

19、腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法，主要包括： 細胞因子基因治療和抗體抗原基因治療,3、免疫性基因治療,3.1 細胞因子基因治療,原理：細胞因子基因治療是應用分子生物學方法 ,將與免疫有關(guān)的細胞因子編碼基因轉(zhuǎn)導入腫瘤或其他免疫效應細胞 ,使其在機體表達，分泌細胞因子或利用其基因增強腫瘤細胞的免疫原性或機體的免疫系統(tǒng)功能 ,進而發(fā)揮抗腫瘤作用。,3、免疫性基因治療,3.1.1細胞因子基因?qū)朊庖咝毎?將細胞

20、因子基因?qū)肽[瘤浸潤淋巴細胞(TILS)或腫瘤特異性殺傷細胞 ,再將這些轉(zhuǎn)基因免疫活性細胞回輸入荷瘤宿主,就能選擇性聚集在腫瘤組織中,產(chǎn)生細胞因子,提高局部細胞因子水平,使轉(zhuǎn)基因免疫活性細胞發(fā)揮較強的抗腫瘤效應。,3. 1 .2細胞因子基因?qū)肽[瘤細胞,在體外將編碼細胞因子的基因?qū)肽[瘤細胞,經(jīng)γ射線等處理使失去致癌性,而保存分泌細胞因子能力,通過細胞因子生物學活性,誘導CTL(特異T細胞）、巨噬細胞和NK細胞的活性及抗體產(chǎn)生,增強抗腫

21、瘤免疫。,3、免疫基因治療,3.2 抗原抗體基因治療,3.2.1抗原基因治療原理：將抗原基因?qū)肽[瘤細胞進行免疫基因治療的設想，是鑒于許多臨床研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞缺乏主要組織相容性復合物（MHC）Ⅰ類或Ⅱ類分子的表達，導致不能將腫瘤抗原運輸至細胞表面，也不能向T細胞提呈抗原，因而不會誘導產(chǎn)生特異性的CTL，使腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視。 采用人MHCⅠ類基因HLA-B7進行黑色素瘤基因治療，在腫瘤細胞中表達同種異體H

22、LA-B7基因，誘導特異性CTL參與的免疫效應。,3、免疫性基因治療,3.2.2 抗體基因治療,原理：①抗體可以誘導特異性細胞毒反應，本身具有一定的抗腫瘤效應，可直接作用于某些癌基因異常表達所致的腫瘤。 曾有美國學者構(gòu)建了一種編碼單鏈抗體的載體 (PGT21)，將其轉(zhuǎn)染到CerB2高表達的腫瘤細胞中， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以通過細胞內(nèi)表達抗CerB2單鏈抗體，抑制腫瘤的生長。,4、提高化學治療效果的輔助基因治療,4.1藥物增敏基因

23、治療： 原理：將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感 性大大增加。 將雞鈣調(diào)素(CaM)基因?qū)胄∈?乳腺癌細胞株C127后，應用較低劑量的長春新堿或長春堿即可抑制該細胞株的生長。其原理是，CaM基因的表達產(chǎn)物作為 細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的重要物質(zhì)，可明顯增加腫瘤細胞對長春新堿和長春堿的吸收量而減少排泄量，從而提高了腫瘤細胞內(nèi)化學治療藥物濃度，導致腫瘤細胞死亡。,4、提

24、高化學治療效果的輔助基因治療,4.2耐藥基因治療,①腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生與多種糖蛋白有關(guān)，包括多藥耐藥基因編碼的P-糖蛋白，多藥耐藥相關(guān)蛋白等。為了降低腫瘤細胞的耐藥性，可以開發(fā)爭對腫瘤細胞耐藥性產(chǎn)生機制的拮抗劑，如阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安。還可以采用基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因的表達，使腫瘤的多藥耐藥性消失。②針對化學治療所致的骨髓細胞造血功能受到抑制的問題，通過向腫瘤患者的骨髓細胞導入某種耐藥基因，如mdr-

25、1等基因，以增強骨髓細胞的抗藥性，以便能耐受大劑量的化學治療藥物，以達到徹底殺滅腫瘤細胞的目的。,04,對未來腫瘤基因治療的展望,04 對未來腫瘤基因治療的展望,經(jīng)過近30年的發(fā)展,基因治療相關(guān)技術(shù)趨于成熟,若干關(guān)鍵技術(shù)獲得突破。因此,未來幾年將是全球基因治療產(chǎn)品上市的重點時期,但基因治療應用于惡性腫瘤等重大疾病的治療還面臨一些挑戰(zhàn),展望未來基因治療的熱點和亟待解決的科學問題還有以下幾個方面,1、基因的體內(nèi)遞送問題

26、 基因的體內(nèi)遞送問題是腫瘤基因治療研發(fā)的熱點和重要科學問題，而如何將基因安全、高效地導入到腫瘤治療部位是基因治療的重要挑戰(zhàn)。目前，大多數(shù)的腫瘤基因治療缺乏靶向性，只能將表達載體導入到體表的腫瘤部位，使得治療只能局限于一些頭頸部腫瘤，即使有部分全身給藥的基因治療方案進入臨床試驗，但由于缺乏腫瘤的靶向性或存在安全性等問題，使得基因難以安全、高效地到達腫瘤部位，最終導致療效不理想，甚至會產(chǎn)生很大的毒性作用,2、基因治療的安全性問題

27、 安全性問題一直是基因治療的熱點問題。1999年兩例由于基因治療引發(fā)的醫(yī)療事故引起了人們對基因治療安全性問題的擔憂。目前，逆轉(zhuǎn)錄病毒使用越來越少，更多基因治療方案使用安全性更高的腺病毒、腺相關(guān)病毒等。為了提高基因治療的安全性，各國科學家和臨床醫(yī)生在不斷改進技術(shù)和優(yōu)化臨床試驗方案,3、基因檢測技術(shù)和基因治療相結(jié)合 隨著基因檢測技術(shù)、大規(guī)模基因測序技術(shù)、生物信息學技術(shù)等的不斷進步，利用基因檢測技術(shù)可以更全面、準確的描