自殺基因治療法腫瘤克星

1、,,自殺基因治療法--腫瘤克星,,盡管腫瘤治療技術(shù)在不斷提高和改進,但每年因患腫瘤而逝世的病人仍在不斷增多。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法,如外科切除、放射治療和化學(xué)藥物治療并不能完全地治愈腫瘤,這就需要引入一種新的安全有效的腫瘤治療技術(shù)。 對腫瘤分子水平上的研究已經(jīng)證實，所有腫瘤都伴隨有基因突變的存在，都是繼基因型變化后發(fā)生表型的變化。由此，人們推斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與基因的變化有關(guān)聯(lián)．因而在生物療法中基因治療是最具潛力的。

2、 至20世紀(jì)80年代后期,隨著生物學(xué)的發(fā)展,基因療法開始應(yīng)用于腫瘤治療。,一.概述,,基因療法：利用健康基因填補或替代基因疾病中某些缺失或病變的基因。 目前做法是先從患者體內(nèi)獲取部分細胞，以對人體無害的逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把正常的基因克隆到病毒上，然后再用這些病毒去感染人體細胞，通過它們把正?；虿暹M細胞的染色體中，使人體細胞 “獲得”正常的基因，以取代原有的異?；颉?現(xiàn)在常用的基因治療技術(shù)主要通過以下幾種策略來完

3、成對腫瘤的治療：,(1)基因替換和基因補充，轉(zhuǎn)換突變的癌基因或補充腫瘤細胞中缺失的抑癌基因；(2)基因?qū)胍栽鰪娒庖咝?yīng)細胞的抗癌效能；如：導(dǎo)入細胞因子基因或免疫共刺激分子基因以增強免疫效應(yīng)細胞的殺癌能力； (3)基因?qū)胍栽鰪娔[瘤細胞的免疫原性，如：導(dǎo)入MHCI類抗原基因； (4)腫瘤藥物敏感基因治療--自殺基因的應(yīng)用；(5)腫瘤藥物耐受基因--治療造血功能的保護；(6)反意治療技術(shù)：根據(jù)堿基互補原理，人工合成特定DNA或

4、RNA片段（或其他化學(xué)修飾產(chǎn)物）抑制或封閉癌基因表達；(7)誘導(dǎo)分化治療：在分化誘導(dǎo)劑的作有用下促進腫瘤細胞分化以達到治療癌癥的目的。,藥物敏感基因---自殺基因治療日益受國內(nèi)外腫瘤研究者的關(guān)注.,自殺基因治療（suicide gene），是指將某些病毒或細菌的基因?qū)氚屑毎?，其表達的酶可催化無毒的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎疚镔|(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細胞被殺死。這類基因稱為自殺基因，又稱藥物敏感性基因。,目前在基因治療中常用的自殺基

5、因系統(tǒng)有大腸桿菌胞嘧碇脫氨酶基因（EC-CD），TK-GCV系統(tǒng)、CD-5-FC系統(tǒng)等。自殺基因療法應(yīng)用較為廣泛，它除了應(yīng)用于腫瘤，骨髓移植，心血管疾病等的治療。,自殺基因治療法治療腫瘤的基本步驟：（1）尋找具有治療意義的目的基因；（2）建立行之有效的向靶細胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng)；（3）目的基因在靶細胞中表達，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，達到治療目的；,二.自殺基因治療法,（一）選擇有效的外源基因（1）HSV-TK/GCV系統(tǒng)：

6、 HSV-TK（單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶）基因：該類基因相對于哺乳動物的TK基因，更易使抗皰疹的核苷類似物磷酸化成為環(huán)腺苷-磷酸； 作用原理：抗皰疹的核苷類似物 環(huán)腺苷一磷酸 環(huán)腺苷三磷酸，通過DNA聚合酶α加入到DNA復(fù)制中，導(dǎo)致鏈反應(yīng)終止以及DNA鏈斷裂。轉(zhuǎn)導(dǎo)了HSV-TK的腫瘤細胞可被清除。 研究表明，只要轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞數(shù)占腫瘤

7、細胞的10%~70%就可使腫瘤完全被清除。（旁觀者效應(yīng)，磷酸化的核苷可通過細胞間隙從陽性細胞傳遞到周圍細胞以及轉(zhuǎn)導(dǎo)后的腫瘤細胞可以分泌白細胞介素IL-6和IL-1作為旁分泌因子介導(dǎo)細胞的死亡）,,HSV-TK（磷酸化）,激酶,（2）CD/5-FC系統(tǒng)：CD（胞嘧啶脫氨酶） ，在細菌和真菌中表達而在哺乳動物中不表達； 無毒性的前體藥物5-氟胞嘧啶（5-FC） 5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-FU可轉(zhuǎn)化為脫氫核苷酸

8、環(huán)腺苷一磷酸(FUTP)，或者直接摻入RNA干擾rRNA和mRNA的功能。此系統(tǒng)也有旁觀者基因的存在。5-FU很容易在細胞內(nèi)和細胞外通過非易化擴散。靠近轉(zhuǎn)導(dǎo)CD后的細胞的其他細胞也被抑制，即使只有2%細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)，腫瘤也能明顯被抑制。,CD,（二）基因?qū)氲妮d體,有效的基因治療依賴于外源基因高效而穩(wěn)定的表達。目前使用的載體有兩大類：轉(zhuǎn)染性載體（利用化學(xué)或物理方法增加膜的通透性而將DNA轉(zhuǎn)染入細胞，有脂質(zhì)體和基因槍）和轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體（利用病毒對

9、細胞的天然親和力把遺傳物質(zhì)引入宿主細胞）。 病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性而成為腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒（AV）、腺相關(guān)?。ˋAV）、單純皰疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等載體。,導(dǎo)入目的基因的方法： 體外法：從患者體內(nèi)取出細胞，在體外培養(yǎng)并轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪x擇系統(tǒng)，把重組的受體細胞回輸患者體內(nèi)，讓外源基因表達 體內(nèi)法：不需細胞移植而直接將外源DNA注

10、射至體內(nèi)，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達而發(fā)揮治療作用。常用的轉(zhuǎn)移手段有病毒介導(dǎo)、寡核苷酸直接注射、受體介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)和體內(nèi)基因直接注射等。,,,基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性,帶有目的基因的載體如何到達“靶細胞”是治療的關(guān)鍵，只有提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性才能實現(xiàn)治療的針對性和安全性，目前解決基因的靶向轉(zhuǎn)移及表達有三種策略：（1）利用基因工程手段改造基因載體，使所包裝的重組病毒特異性地識別位于靶細胞表面的抗原或受體決定簇；（2）在體內(nèi)基因傳遞系統(tǒng)中共價連接腫

11、瘤抗體和腫瘤細胞特異受體的配基，使基因在類似“生物導(dǎo)彈”作用下被送到腫瘤細胞表面；（3）應(yīng)用腫瘤細胞特異蛋白管家基因的表面調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因在靶細胞中的表達。,,各種組織靶向細胞及其優(yōu)點：骨 髓：容易獲得；可體外培養(yǎng)；易返回機體上皮細胞：使用腺病毒可在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入呼呼上皮；經(jīng)內(nèi) 窺鏡接近腸上皮進行體細胞基因療法皮 膚：最容易大面積接近的組織；干細胞可使表面持續(xù)更新；皮

12、膚中轉(zhuǎn)基因表達可影響全身血管內(nèi)皮；外源性遺傳物質(zhì)可轉(zhuǎn)入血管組織內(nèi)皮細胞間 皮：間皮覆蓋了體腔內(nèi)表面，由單層細胞組成肌 肉：裸露質(zhì)粒DNA可注射轉(zhuǎn)入骨骼肌或心肌?；蜣D(zhuǎn)入骨骼肌后可在體內(nèi)持續(xù)表達并釋放治療性蛋白質(zhì)神 經(jīng)：基因?qū)肽X循環(huán)；基因?qū)肽X脊液；CNS間接打靶技術(shù)肝 臟：肝臟疾病的基因療法的重要靶器官胰 腺：基因轉(zhuǎn)入胰腺為治療胰腺癌等提供了可能眼 組 織：眼組織內(nèi)注射可作

13、為基因治療的靶,雖然基因治療法這項技術(shù)在許多醫(yī)療方面已經(jīng)獲得不少進步，但要想成功地將其運用到醫(yī)療實踐當(dāng)中以攻克腫瘤卻是任重而道遠。,,存在哪些問題？,（一） “旁觀者效應(yīng)”的作用機制有待進一步研究,“旁觀者效應(yīng)”(by—stander effect) ：即導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細胞對鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細胞也有殺傷作用。具體作用機制目前有五種觀點： 縫隙連接、細胞凋亡、機體免疫、介質(zhì)擴散、腫瘤缺血壞死 。,,縫隙連接：為大多

14、數(shù)研究者所認(rèn)同。該假說認(rèn)為轉(zhuǎn)染自殺基因的細胞產(chǎn)生的殺傷性物質(zhì)是通過細胞間的縫隙連接傳遞到臨近細胞的．這種現(xiàn)象又稱之為“死亡之吻”(kiss of death)。細胞凋亡：轉(zhuǎn)染自殺基因的腫瘤細胞死亡之后產(chǎn)生凋亡小體，其凋亡小泡包裹著自殺基因的表達產(chǎn)物和一些毒性代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物被鄰近的未轉(zhuǎn)染自殺基因的腫瘤細胞吞噬，從而引起腫瘤細胞的繼發(fā)凋亡。免疫作用：轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細胞的HSV—TK可以改變腫瘤組織內(nèi)的微環(huán)境，使之從免疫抑制狀態(tài)到免疫激活

15、狀態(tài)。Hogge,-laj和Shi 0 兩學(xué)者報道自殺基因引起腫瘤細胞死亡后．釋放出腫瘤源性肽類被APC 攝取，然后激活CTI 細胞．而局部GM—CSF的表達能增強這種抗原遞呈功能，從而達到增強旁觀者效應(yīng)。介質(zhì)擴散：互相不接觸的腫瘤細胞也能發(fā)生旁觀者效應(yīng)。在細胞質(zhì)中的分子和離子．只要其分子量小于1kDa時．它們就可以自由出入細胞。某些自殺基因系統(tǒng)的前體藥物在酶的作用下產(chǎn)生有毒性的小分子代謝產(chǎn)物，如CD／5一FC 系統(tǒng)的毒性產(chǎn)物5-FU

16、，5-FU 能夠自由擴散進出細胞將腫瘤細胞殺死腫瘤缺血壞死 ：以Ram為首等人 發(fā)現(xiàn)．由于腫瘤分泌血管生長因子，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血管的內(nèi)皮細胞有絲分裂活躍．易于被攜帶TK 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所染．經(jīng)GCV治療后，腫瘤血管內(nèi)皮細胞被有效地殺傷．從而抑制了腫瘤血管生長，減少腫瘤的血供，使腫瘤缺血壞死。,,在腫瘤治療中，盡管自殺基因療法具有很大潛力，但目前進行的工作還是探索性的，絕大多數(shù)尚處于實驗階段，要使自殺基因治療成為臨床上安全有效的抗腫瘤

17、治療方法，尚存在許多問題需要解決。,三.存在哪些問題？,（一）還需進一步研究“旁觀者效應(yīng)”的機制,“旁觀者效應(yīng)”(by—stander effect) ：即導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細胞對鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細胞也有殺傷作用。具體作用機制目前有五種觀點： 縫隙連接、細胞凋亡、機體免疫、介質(zhì)擴散、腫瘤缺血壞死,,基因治療的載體系統(tǒng)要求： （1）轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。（2）表達穩(wěn)定。（3）安全。目前用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

18、，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，脂質(zhì)體等，但各載體各有其優(yōu)缺點如：應(yīng)用較廣的鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒MoMLV，感染效率高，能持續(xù)表達，較安全但其攜帶外源基因的容量較小，且感染特異性不高，重組病毒的概率較低。腺病毒載體的優(yōu)點是感染效率高，可攜帶的基因較大，致死性和致瘤性低，使用安全，缺點是不能持續(xù)表達，不能反復(fù)使用。因此，還必須加強基因治療的靶向性研究，開發(fā)出新的既安全又高效的載體系統(tǒng)。,（二）載體難尋,（三）作用不持久,進一步研究自殺基因

19、系統(tǒng)和機體免疫系統(tǒng)的相互作用機制，以激活和增強機體強大而持久的抗腫瘤免疫。,,新的希望：聯(lián)合基因治療 聯(lián)用TK、mIL-2及粒、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因治療肝轉(zhuǎn)移灶，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗腫瘤免疫更持久 。,,鑒于癌癥仍為威脅人類健康的一類頑固性疾病，目前的化療、放療及手術(shù)治療等方法的作用都有局限，作為新興的生物療法中的自殺基因治療在許多方面都因其獨特的作用機制而顯示出巨大的潛能．由于目前自殺基因療法還沒有大規(guī)模地進入臨

20、床實驗．所以我們還無法準(zhǔn)確預(yù)測其在未來癌癥治療中的作用，但或許它就是癌癥的終結(jié)者。根據(jù)目前自殺基因治療的現(xiàn)狀，我們相信這一療法會在未來有所發(fā)展，有所突破，為人類造福。,四.展望,,首先，還是如何增強基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、精確靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)、時空調(diào)控表達、長效穩(wěn)定表達以及提高安全性能等問題，這些問題的有效解決尚需新一代載體的開發(fā)應(yīng)用。其次，單一自殺基因系統(tǒng)療效欠佳，新型融合自殺基因系統(tǒng)的開發(fā)與完善是將來的發(fā)展方向。再者，對于旁觀者效應(yīng)機制的闡明，還需進