miR-218抑制宮頸癌細(xì)胞EMT、侵襲遷移及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　宮頸癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率僅次于乳腺癌，位居全球第二。超過(guò)85％的患者位于發(fā)展中國(guó)家，是嚴(yán)重危害女性身體健康的一種惡性腫瘤，其致死性的主要原因是腫瘤的治療失敗、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步是局限性的侵襲，這需要原發(fā)腫瘤發(fā)生許多表型的改變，其中惡性腫瘤的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-to-me senchymal transition，EMT)是引起腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵

2、步驟之一。正常上皮組織的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)不利于惡性腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲，為了獲得運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，腫瘤細(xì)胞必須丟失許多的上皮細(xì)胞的表型，使上皮層能夠發(fā)生EMT。發(fā)生EMT的細(xì)胞，一方面失去了上皮細(xì)胞的典型形態(tài)，上皮細(xì)胞之間的相互作用消失，組織結(jié)構(gòu)也相對(duì)松散，立方上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形纖維細(xì)胞的形態(tài)，并且表現(xiàn)出侵襲性;另一方面，細(xì)胞的基因表達(dá)譜也發(fā)生改變，上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白如E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白如N-cadheri

3、n表達(dá)上調(diào)。惡性實(shí)體腫瘤中央的細(xì)胞為上皮細(xì)胞的表型，周圍細(xì)胞常常會(huì)呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，因此周圍細(xì)胞往往具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力而促使腫瘤細(xì)胞在局部產(chǎn)生浸潤(rùn)，并且侵入到血管和淋巴管進(jìn)而轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處靶器官，隨后惡性腫瘤的細(xì)胞可以發(fā)生間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化(mesenchymal—epithelial transitions，MET)來(lái)重建細(xì)胞之間的連接以及細(xì)胞骨架，從而形成轉(zhuǎn)移灶。因此EMT是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)的可逆的變化過(guò)程。
　　microR

4、NA(miRNA)是廣泛存在于真核生物中的非編碼的小分子RNA。miRNA具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，即成熟的miRNA通常是由長(zhǎng)度為20-25個(gè)核苷酸的單鏈結(jié)構(gòu)組成，其5'端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。miRNA與其靶基因的mRNA的3'非編碼區(qū)相結(jié)合，能夠通過(guò)抑制靶基因mRNA翻譯和促進(jìn)mRNA的降解而抑制靶基因的表達(dá)。由于miRNA與靶基因的結(jié)合并不是完全互補(bǔ)的，因此，同一個(gè)miRNA可以有多個(gè)不同的靶點(diǎn)。而在同一個(gè)miRNA中有兩條部

5、分互補(bǔ)的雙鏈，根據(jù)miRNA在其前體pre-miRNA上的位置分別命名為5p和3p，這兩條鏈可以結(jié)合在不同的mRNA上，各自行使不同的功能。目前，一系列的研究證據(jù)表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，能夠影響細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移以及EMT。目前所發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的miRNA，一部分能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，具有促進(jìn)惡性腫瘤的作用，而另一些則能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮抑制惡性腫瘤的作用。
　　人類SFMBT1是一種PcG蛋白，

6、也屬于MBT(malignant brain tumor)蛋白家族，在維持轉(zhuǎn)錄沉默方面具有重要作用。研究表明SFMBT1可間接促進(jìn)HSC/前體細(xì)胞活性，在維持造血干細(xì)胞的干性特征方面發(fā)揮重要作用。SFMBT1調(diào)節(jié)MyoD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默從而穩(wěn)定肌源性前體細(xì)胞的未分化狀態(tài)，并能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中DCUN1D1是miR-218的靶基因，受到miR-218下調(diào)。干擾DCUN1D1能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的侵

7、襲和遷移，而過(guò)表達(dá)DCUN1D1能夠逆轉(zhuǎn)miR-218對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果提示，DCUN1D1的下調(diào)在miR-218抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-218在多種腫瘤中異常表達(dá)。miR-218在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌和宮頸癌等惡性腫瘤中均表達(dá)量降低，且在轉(zhuǎn)移腫瘤的表達(dá)低于良性腫瘤。在上述腫瘤miR-218低表達(dá)與侵襲遷移及

8、不良預(yù)后密切相關(guān)。這些研究說(shuō)明miR-218在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。雖然這些研究將miR-218與腫瘤轉(zhuǎn)移聯(lián)系在一起，但miR-218的具體功能以及相應(yīng)的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。本研究旨在探究miR-218對(duì)宮頸癌轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　SiHa、HeLa細(xì)胞使用高糖DMEM，分別添加10％胎牛血清，在37℃、CO2的濃度為5％，相對(duì)濕度為50％細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

9、，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度適時(shí)更換培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA工作液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代或接種培養(yǎng)。
　　2、侵襲遷移試驗(yàn)
　　選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代至24或12孔培養(yǎng)板，正常過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞融合密度達(dá)80％左右時(shí)，采用invitorgen公司lipofactemin2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作參考說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行侵襲和遷移的檢測(cè)或提取細(xì)胞的總蛋白等。遷移試驗(yàn)時(shí)用無(wú)血

10、清培養(yǎng)基重懸1.0×105細(xì)胞接種于BD小室內(nèi);侵襲試驗(yàn)時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸2.0×105細(xì)胞接種于Matrigel包被的BD小室內(nèi)。37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后取出小室，用PBS輕輕漂洗，用95％甲醇室溫固定20min;0.25％結(jié)晶紫（甲醇配制）染色，室溫染色30min，清水漂凈，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞;鏡下拍照計(jì)數(shù)。
　　3、免疫印跡試驗(yàn)
　　冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白;SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移PVDF膜;5％脫脂

11、奶粉封閉1小時(shí);4℃孵育—抗過(guò)夜;常溫孵育二抗1小時(shí);化學(xué)發(fā)光法膠片曝光，掃描。
　　結(jié)果：
　　1、miR-218在宮頸癌組織中低表達(dá)并且能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT及侵襲遷移
　　(1) miR-218在宮頸癌組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織，并與腫瘤分期負(fù)相關(guān)
　　為了進(jìn)一步研究在miR-218與宮頸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我們應(yīng)用組織芯片分析了miR-218與宮頸癌病理參數(shù)的關(guān)系。含有104例福爾馬林固定石蠟包埋的宮頸癌

12、及癌旁正常宮頸組織的組織芯片的原位雜交結(jié)果顯示，miR-218在宮頸癌組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織，在發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中的表達(dá)低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織。這一結(jié)果說(shuō)明miR-218與宮頸癌的進(jìn)展及臨床分期呈負(fù)相關(guān)。
　　(2) miR-218抑制宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　為了研究miR-218對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響，我們?cè)趯m頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa分別轉(zhuǎn)染miR-218的mimics和miR-218的抑制劑，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)

13、染miR-218的mimics，增強(qiáng)miR-218的表達(dá)后能夠抑制宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。首先我們轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，48h后觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組的SiHa細(xì)胞短圓相比，轉(zhuǎn)染miR-218的抑制劑的細(xì)胞形態(tài)變得瘦長(zhǎng)，呈梭形，由上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化。
　　2、miR-218抑制宮頸癌EMT及侵襲遷移的機(jī)制
　　(1) SFMBT1和DCUN1D1是miR-218的靶點(diǎn)
　　尋找miRNA的下游靶基因，是研究miRNA

14、作用機(jī)制的關(guān)鍵。我們結(jié)合生物信息學(xué)策略篩選miR-218的潛在靶點(diǎn)。首先，分別應(yīng)用TargetScan、PicTar、miRanda靶基因預(yù)測(cè)軟件篩選靶基因。結(jié)合miR-218的功能，我們篩選到8個(gè)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因，分別是HAPLN1、SFMBT1、RNF38、UGT8、ARID4B、BCAT1、CTNND2和DCUN1D1。
　　為了驗(yàn)證這些基因是否是miR-218的直接靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示含有SFM

15、BT1和DCUN1D1野生型3'端非編碼區(qū)的報(bào)告基因載體的熒光素酶活性有顯著的下降，而其它靶基因沒(méi)有顯著下降。這一結(jié)果初步顯示SFMBT1和DCUN1D1是miR-218的直接靶點(diǎn)。
　　(2) miR-218通過(guò)抑制SFMBT1和DCUN1D1的表達(dá)而抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力。
　　為了明確miR-218的功能靶基因，我們分別應(yīng)用特異性的小干擾RNA和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒下調(diào)或上調(diào)宮頸癌細(xì)胞SFMBT1和DCUN1D1的表達(dá)，應(yīng)

16、用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SFMBT1和DCUN1D1對(duì)宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SFMBT1或DCUN1D1后，宮頸癌細(xì)胞SiHa的侵襲能力增強(qiáng)。干擾SFMBT1或DCUN1D1后，宮頸癌細(xì)胞SiHa的侵襲能力下降。
　　(3) miR-218通過(guò)抑制SFMBT1抑制宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　過(guò)表達(dá)SFMBT1后SiHa細(xì)胞的形態(tài)變得瘦長(zhǎng)，呈梭形，這與干擾miR-218的作用一致。而過(guò)表達(dá)DC

17、UN1D1后，SiHa細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯變化。此外，過(guò)表達(dá)SFMBT1能夠逆轉(zhuǎn)miR-218對(duì)SiHa細(xì)胞形態(tài)的改變。這樣，我們首次發(fā)現(xiàn)下調(diào)SFMBT1能夠抑制宮頸癌EMT。綜上，SFMBT1可能是miR-218抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子。
　　結(jié)論：
　　本研究中，我們首次揭示了miR-218在宮頸癌EMT和侵襲遷移過(guò)程中的作用及其機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中miR-218表達(dá)降低，且在宮頸癌中的表達(dá)量低于正常宮頸組織。在宮頸癌細(xì)胞