CCL21-CCR7在結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移過程中生物學(xué)意義的研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文CCL21CCR7在結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移過程中生物學(xué)意義的研究姓名：孫仁虎申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師：王國斌20090501華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文4第二部分第二部分CCR7shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建及對及對SW480細(xì)胞的沉默效應(yīng)細(xì)胞的沉默效應(yīng)目的：設(shè)計(jì)并構(gòu)建靶向CCR7基因短發(fā)夾RNA(shthairpinRNAshRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒，并檢測其對人結(jié)腸癌S

2、W480細(xì)胞中CCR7表達(dá)的干擾效果。方法：以CCR7為靶基因設(shè)計(jì)具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的模板寡核苷酸，退火形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，再克隆至pGCsilencerCRM30載體，構(gòu)建的3條重組shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pGCsilencerCRM30_CCR7A、_CCR7B和_CCR7C。采用測序法鑒定寡核苷酸序列。將構(gòu)建好的3條shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，RTPCR法檢測CCR7mRNA干擾效果

3、，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，以實(shí)現(xiàn)最佳干擾效果；選取干擾效果最佳的1條shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，并通過G418篩選穩(wěn)定表達(dá)CCR7shRNA的細(xì)胞株。結(jié)果：重組質(zhì)粒測序結(jié)果與Genebank中的CCR7cDNA序列相符，轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白；RTPCR結(jié)果顯示，pGCsilencerCRM30_CCR7C干擾效果最強(qiáng)。將pGCsilencerCRM30_CCR7C轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，并通過G418篩